刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建

发布时间：2018-03-28 08:34

  本文选题：刚地弓形虫　切入点：棒状体蛋白　出处：《中国病原生物学杂志》2017年01期

【摘要】：目的构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)、棒状体蛋白18(TgROP18)复合基因真核表达重组质粒,并验证其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒pVAX1-ROP16与pVAX1-ROP18分别经EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ双酶切,将ROP16与ROP18基因先后克隆至双启动子真核表达载体质粒pVAXD的多克隆位点中,构建pVAXD-ROP16-ROP18重组质粒。分别用双酶切和PCR验证正确的重组质粒及对照组质粒转染Hela细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板进行ROP16基因、ROP18基因与管家基因β肌动蛋白基因的RT-PCR扩增,采用间接免疫荧光法检测各自基因的表达。结果重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18经PCR及双酶切鉴定构建正确。转染后经RT-PCR检测,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组ROP16基因、ROP18基因扩增产物分别为1 700bp和2 100bp,与预期大小相符,而对照组均未扩增出ROP16及ROP18基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。结论成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,该质粒可在真核细胞中表达。
[Abstract]:Objective to construct the Toxoplasma gondii rhoptry protein 16 (TgROP16), rhoptry protein 18 (TgROP18) recombinant eukaryotic expression plasmid encoding complex gene, and verify its expression in eukaryotic cells. Methods the recombinant plasmid pVAX1-ROP16 and pVAX1-ROP18 respectively by EcoR I and Not I, Nhe I and Afl II double enzyme digestion. Multiple cloning sites ROP16 and ROP18 genes were cloned into the dual promoter eukaryotic expression plasmid pVAXD to construct the recombinant plasmid of pVAXD-ROP16-ROP18, respectively. The correct recombinant plasmid by double enzyme digestion and PCR verification and control group was transfected into Hela cells. The cell total RNA extraction and reverse transcription cDNA, ROP16 gene was used as a template ROP18, gene and the housekeeping gene beta actin gene was amplified by RT-PCR, the expression of the respective genes detected by indirect immunofluorescence. Results the recombinant plasmid pVAXD-ROP16-ROP18 PCR and double enzyme digestion. After transfection, Gou Jianzheng By RT-PCR detection, the experimental group and the control group of beta actin gene amplification were consistent with the expected size, experimental group, ROP16 gene, ROP18 gene amplification products were 1 700bp and 2 100bp, consistent with the expected size, while the control group were not amplified ROP16 and ROP18 genes. Indirect immunofluorescence detection showed. The recombinant plasmid pVAXD-ROP16 pVAXD-ROP18 transfected cells showed green fluorescence, empty plasmid control group and no green fluorescence. Conclusion: the recombinant plasmid pVAXD-ROP16-ROP18, the plasmid can be expressed in eukaryotic cells.

【作者单位】： 河北北方学院病原生物学与免疫学研究所;
【基金】：河北省自然科学基金项目(No.2013405091) 河北北方学院校级重大课题(No.ZD201312)
【分类号】：R382.5

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