甜瓜伐昔洛韦水解酶和持绿蛋白基因家族的全基因组鉴定及分析

发布时间：2018-04-01 19:07

本文选题：甜瓜　切入点：伐昔洛韦水解酶　出处：《内蒙古大学》2016年博士论文

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是世界十大水果之一,具有重要的经济价值,也是研究葫芦科植物果实发育成熟的模式植物。2012年6月甜瓜全基因组测序已完成并公布,为利用生物信息学方法研究新基因及其功能奠定了基础。本研究利用生物信息学方法从甜瓜基因组中鉴定了伐昔洛韦水解酶(valacyclovir hydrolase,VACVase)、持绿蛋白(staygreen protein,SGR)和非黄化蛋白(non-yellow coloring,NYC)基因家族,并进行了生物信息学、表达特性、亚细胞定位和功能分析。主要结果如下：1)本文从甜瓜基因组中鉴定得到两个VACVase,命名为CmVACVase1和CmVACVase2,通过生物信息学分析表明,该蛋白家族高度保守,两个蛋白均无信号肽结构,属于非分泌性蛋白,CmVACVase1和CmVACVase2分别含有4个和3个跨膜结构,属于跨膜蛋白,且分别含有24和15个磷酸化位点。通过启动子分析发现,除了核心元件(CAAT-box、TATA-box、5'UTR Py-rich等)外,含有多种激素应答元件、组织特异表达以及时空特异表达的调控元件。蛋白互作网络分析中分别获得了一个高度同源的映射蛋白,且分别与10个和8个蛋白进行互作。每个基因均搜索得到了2个miRNA,一个是通过互补形式降解靶mRNA,另一个是通过阻遏靶mRNA的翻译来抑制目的基因的表达。从甜瓜基因组中鉴定得到一个NYC蛋白和4个与NYC同源的SGR蛋白,分别命名为CmNYC、CmSGR1～CmSGR4。生物信息学分析显示,CmNYC蛋白含有酯酶/脂肪酶亚家族保守基序(G-X-S-X-G/A),是一个偏弱酸性的不稳定蛋白,其N末端无叶绿体转运肽结构,含有两个跨膜结构,属于跨膜蛋白,且含有27个磷酸化位点。SGR基因家族是NYC蛋白的同源基因,具有相似的功能,该家族蛋白C末端含有一个高度保守的基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P),但是在进化过程中,CmSGR3、CmSGR4则缺失了该基序,其家族蛋白的N末端均无叶绿体定位信号肽结构,也没有跨膜结构,不属于跨膜蛋白。2)从甜瓜中分别克隆得到了CmVACVase1、CmVACVase2、CmNYC、CmSGR1、 CmSGR2五个基因的cDNA,分别编码458、398、499、216和257个氨基酸,分子量在24.8-55.4 kDa之间。3)实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)结果显示,CmVACVase1、CmVACVase2在45 DAP的果实中表达量最高,分别是叶片中表达量的355倍和2.6倍,果实发育初期表达量最低,属于果实成熟过程中高表达基因。CmNYC在叶片和子叶中的表达量较高,而果实中表达量较低,但随着果实发育其表达量开始缓慢上升。CmSGR1、CmSGR2的表达量在45 DAP的果实中最高,并且随着果实发育成熟其表达量缓慢上升。而CmSGR3、CmSGR4在叶片、茎和子叶中表达较高,在果实授粉后其表达量开始缓慢降低,到30DAP后表达量有所增加,但幅度不大。4)构建CmVACVase1和CmVACVase2的亚细胞定位载体pUC18-CmVACVase1-GFP和pUC18-CmVACVase2-GFP,转化洋葱表皮细胞,CmVACVase1和CmVACVase2均定位于细胞膜上,属于一类膜蛋白,与预测结果一致。5)瞬时表达结果显示,CmVACVase1和CmVACVase2基因的过表达和RNAi果实注射部位均呈现绿色表型。注射p35S-VACVase1和p35S-VACVase2的果实中表达量分别为对照组的2.21和2.25倍,在CmVACVase1过表达果实中,木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(Xyloglucan Endotransglucosylase/hydrolase, XTH)基因表达量是对照组的8.1倍,在CmVACVase2过表达果实中,扩张蛋白(expansion protein, EXP)和八氢番茄红素合成酶(1phytoene synthase, PSY)基因表达量分别为对照组的1.7倍和1.5倍。在CmVACVasel的RNAi果实中,ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)和ACC合成酶(ACC synthetase, ACS)基因表达量分别为对照组的3.2倍和2.2倍,其它果实发育相关基因的表达量受到明显的抑制。在CmVACVase2的RNAi果实中,p-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)和EXP基因表达量分别为对照组的51倍和23倍。注射p35S-NYC、p35S-SGR1、 p35S-SGR2果实部位均呈现黄色表型,叶绿素降解明显,而注射ART27-NYC、 pART27-SGR1、pART27-SGR2部位呈现出持绿特征。应用生物信息学方法首次从甜瓜全基因中鉴定得到CmVACVase1、 CmVACVase2、 CmNYC、 CmSGRl、CmSGR2基因并克隆了其cDNA,明确其家族基因结构、系统进化关系、编码蛋白质的基序特点和分布,通过瞬时表达的方法来研究该基因家族的功能,为深入研究其作用机理奠定了基础。对CmVACVasel、CmVACVase2在植物体内的催化功能提供新的认识,为进一步探究CmVACVase家族基因在植物体内的功能提供基础研究资料。为进一步明确CmNYC/CmSGR对甜瓜叶绿素降解、衰老、果实成熟的调控分子机理打下了良好的基础。
[Abstract]:In this paper , we identified two kinds of genes , such as valeroxide , VACVase , staygreen protein , SGR and non - yellow protein . The expression of CmSGR3 and CmSGR 2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 and CmVase2 were the highest in 45 DAP . In the fruit of CmVACVase2 , the expression of ACC oxidase ( ACC oxidase , ACO ) and ACC synthetase ( ACC oxidase , ACS ) was significantly inhibited .

【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S652

【参考文献】