柑桔全爪螨超氧化物歧化酶基因克隆与功能初探

发布时间：2018-04-01 20:40

本文选题：柑桔全爪螨　切入点：超氧化物歧化酶　出处：《西南大学》2016年硕士论文

【摘要】：当生物体遭受环境胁迫时,体内会诱导产生大量的活性氧(ROS),ROS的累积会破坏蛋白质、核酸和脂质膜等大分子结构。超氧化物歧化酶是生物体内最重要的抗氧化酶之一,对于维持细胞内的ROS平衡起着至关重要的作用。柑桔全爪螨是一种寄主范围广,发生持续时间长的世界性害螨,目前对该螨的防治手段主要以化学防治为主,杀螨剂长期不科学的使用使柑桔全爪螨产生了较为严重的抗药性,因此亟需从可持续及绿色的角度重新思考对该螨的防控策略。据此,为深入了解柑桔全爪螨对环境胁迫的适应机制,本学位论文对柑桔全爪螨的超氧化物歧化酶基因进行了较为系统的研究,主要结果如下:1.柑桔全爪螨3个SOD基因的序列及系统发育分析根据本课题组测序获得的柑桔全爪螨转录组数据,筛选目标序列及设计引物,克隆获得了3个SOD基因的开放阅读框,分别命名为PcSOD1(KJ522695)、PcSOD2(KJ700412)和PcSOD3(KJ700411)。通过编码蛋白质的分子量、特征序列和信号肽结构分析,结果表明柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3基因分属于细胞质CuZnSOD、细胞外CuZnSOD和线粒体MnSOD。氨基酸多重序列比对分析发现,SOD1和SOD3在不同物种间的相似性高达70%,而SOD2的相似度仅为35%左右。系统发育关系分析结果表明所有的SOD蛋白被划分为3个大的分支,说明柑桔全爪螨3个SOD基因在金属结合位点、特征基序和相对分子量等方面存在差异,可能导致其抗氧化功能亦存在差异。2.柑桔全爪螨SOD基因在环境胁迫条件下的表达模式解析环境胁迫能够导致生物体内ROS的累积,从而诱导SOD基因的表达上调。研究选取了重金属、杀螨剂、紫外线(UV-B)和极端温度4种类型的环境胁迫条件,利用实时荧光定量PCR技术对柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3在氧化胁迫条件下的表达特性进行分析。结果显示,在UV-B和极端温度(0°C和41°C)胁迫下,PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3的表达水平均显著性上调,且上调倍数较高,说明UV-B和极端温度是导致柑桔全爪螨体内产生氧化损伤的重要环境因子。在重金属离子(Mn2+、Cu2+和Cd2+)、0°C和UV-B处理后,PcSOD3的表达水平均显著高于另外2个CuZnSOD基因,说明MnSOD基因是典型的诱导性基因,同时暗示PcSOD3可能比PcSOD1和PcSOD2具有更为重要的抗氧化功能。3.柑桔全爪螨PcSOD3的原核表达以大肠杆菌BL21(DE3)作为原核表达菌株,成功实现了pET28α-PcSOD3重组蛋白的异源表达,利用重组蛋白所含有的His标签与Ni柱结合,获得纯化的重组蛋白。通过Western Blot验证,表明所获得的重组蛋白为PcSOD3重组蛋白,该重组蛋白酶活力为276.61 U/mg,说明该重组蛋白具有抗氧化功能。酶学性质分析发现该重组蛋白酶促反应的最适温度为35℃,最适pH为7.0。4.柑桔全爪螨MnSOD和CuZnSOD抗氧化功能差异分析在大肠杆菌中过量表达PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3的基础上,以pET28α空载体为对照,基于滤纸片药敏法测量三种氧化胁迫条件下的抑菌圈直径,分析3个SOD重组蛋白的抗氧化功能差异。结果显示,在三种氧化胁迫条件下,大肠杆菌中过量表达PcSOD3后抑菌圈的缩小程度均高于过量表达PcSOD1和PcSOD2后的抑菌圈直径,说明柑桔全爪螨MnSOD(PcSOD3)比CuZnSOD(PcSOD1和PcSOD2)具有更强的抗氧化能力。综上所述,本学位论文为探究超氧化物歧化酶基因参与柑桔全爪螨对环境胁迫的适应机制,从转录组筛选获得了3种不同亚型的超氧化物歧化酶基因序列,验证后命名为PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3,分析了3个基因的序列特征和系统进化关系以及在环境胁迫下的表达模式;通过对上述基因进行原核表达和药敏试验,对3个基因的抗氧化功能进行了初步分析。研究结果为深入探究超氧化物歧化酶在柑桔全爪螨抗氧化胁迫中的生理功能和制订害螨新的防控策略提供了基础数据。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.661.23

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