甜瓜抗霜霉病基因AT2功能验证

发布时间：2018-04-03 05:24

  本文选题：AT2基因　切入点：氨基转移酶　出处：《新疆大学》2016年硕士论文

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一种全世界广泛种植的园艺作物,新疆作为我国甜瓜的主产区,种植面积大且品种资源丰富。但由于霜霉病(Pseudoperonospora cubensis Rostov.)的频繁发生,造成甜瓜植株枯萎、死亡,很大程度上降低了甜瓜产量和品质,严重制约甜瓜产业健康、快速发展。由于新疆栽培品种无霜霉病抗性,因此选育具霜霉病抗性甜瓜品种极为迫切。基因工程的迅速发展为植物抗病育种工作提供了非常有效的技术手段,通过研究植物自身的抗病基因来提高植物的抗病性,是控制病害安全理想的途径。本实验以甜瓜抗霜霉病基因AT2为研究对象,通过RT-PCR法从MR-1中克隆得到AT2,利用在线预测软件等生物信息学方法对AT2及其编码的酶蛋白序列进行二级结构预测分析;同时通过荧光定量PCR检测AT2在甜瓜植株中的表达特性。构建p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,利用农杆菌介导法同时对新疆感霜霉病甜瓜品种“老汉瓜”和烟草遗传转化,得到阳性转基因甜瓜T0代及转基因烟草T0、T1代,以此为实验材料分析AT2基因的功能。主要研究结果如下:(1)AT2基因的克隆、序列分析及表达特性分析从抗霜霉病甜瓜品种MR-1中克隆得到了AT2的基因序列,经分析,其c DNA全长为1229bp,共编码401个氨基酸。与Gen Bank中甜瓜aminotransferase 2序列比对同源性达99%,根据氨基酸序列推测的蛋白结构中含有一个与抗病相关的5-磷酸吡哆醛位点GSQKAL和一个过氧化物体定位信号SRI位点;二级结构预测分析此蛋白包含18个β-折叠位点,15个α-螺旋位点。MR-1不同生长时期和不同部位AT2基因表达量均有不同:其中开花期AT2基因表达量最高;且叶片的AT2基因表达量显著高于茎、根,这表明该基因随着甜瓜的生长发育而表达升高,与植物发育时期光呼吸的动态变化趋势相似。(2)AT2基因植物表达载体的构建构建了pCAMBIA2300-AT2载体,转入农杆菌EHA105。(3)AT2基因遗传转化对甜瓜外植体再生效率、抗生素筛选浓度均进行了优化探索,确定了适合本实验的甜瓜遗传转化条件。以感病甜瓜品种“老汉瓜”和模式植物烟草为实验材料,通过农杆菌介导法进行转化,获得3株阳性转基因甜瓜、7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,转基因甜瓜、烟草T0代中AT2基因表达量均高于野生型。对转基因烟草T0种子进行卡那霉素(Kan)抗性筛选并统计T1代幼苗的Kan抗性分离比,结果有5个株系的Tl代幼苗按3:1分离;并检测到AT2基因,说明目的基因在T1代转基因烟草中遗传稳定。(4)转基因植株SGT活性检测、抗病性鉴定及生理生化分析提取转基因甜瓜、烟草叶片粗蛋白液,检测转基因植株中丝氨酸乙醛酸转氨酶的活性。表明转基因植株叶片中的SGT酶粗提液具有催化转氨反应的能力,且显著高于野生型。接菌实验表明转基因甜瓜对霜霉病具有一定抗性;转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草;且接菌后转基因植株叶片中SGT、GOX、SOD、GST、APX酶活性显著高于野生型;H2O2含量升高。说明正处于胁迫状态的转基因植株有更强的防御能力。
[Abstract]:Muskmelon L . is a widely cultivated horticultural crop in the world . Xinjiang is the main production area of sweet melon in China . The planting area is large and the variety resources are abundant . However , Pseudoperonospora cubensis Rosicker is caused by downy mildew . The gene sequence of AT2 gene was cloned from MR - 1 by RT - PCR . ( 3 ) The genetic transformation of AT2 gene has been optimized for the regeneration efficiency and antibiotic screening concentration of sweet melon .

【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.5;Q943.2

【参考文献】

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本文编号：1703824