阿维菌素杀螨活性作用靶标及其抗性相关基因鉴定

发布时间：2018-04-03 15:52

本文选题：朱砂叶螨　切入点：阿维菌素　出处：《西南大学》2016年博士论文

【摘要】：阿维菌素类药剂是一种具有良好活性的杀虫、杀螨和杀线虫剂,目前被广泛用于农业生产害虫以及卫生害虫的防治,其发现者日本科学家大村智和爱尔兰科学家坎贝尔也据此获得了2015年诺贝尔生理或医学奖。阿维菌素类杀虫剂的毒理学机制和害虫对其的抗性机制研究是杀虫剂毒理学的热点之一,但在叶螨中的研究目前仍然十分缺乏。目前,阿维菌素对叶螨的毒理学机制研究主要存在以下两个问题:一是叶螨对阿维菌素的抗性机制主要集中于已知代谢酶及其编码基因的研究,是否存在其它类型的基因参与叶螨对阿维菌素抗性的形成;二是阿维菌素对叶螨作用的分子靶标以及靶标抗性机制尚不明确。因此,本论文以“朱砂叶螨-阿维菌素类杀螨剂”为研究对象,以解决以上两个问题为研究目标,进行了朱砂叶螨阿维菌素抗性基因及分子靶标鉴定的系统研究,取得了以下研究成果:1.朱砂叶螨敏感及阿维菌素抗性品系基因芯片检测在表达谱测序获得敏感及阿维菌素抗性品系间差异表达基因的基础上,运用基因芯片技术进一步验证这些差异表达基因。检测结果显示:相对于敏感品系,阿维菌素抗性品系共有52条差异表达基因(21条表达上调,31条表达下调);差异表达基因Gene Ontology(GO)功能注释发现其中14条差异表达基因可以注释到12个GO分类;参考二斑叶螨基因组对差异表达基因进行注释和分析,发现抗性品系中上调表达基因包括两条谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)基因,一条细胞色素P450基因和一条酯酶基因;下调表达基因中包括6条表皮蛋白基因;此外我们也首次发现大量其它基因可能与阿维菌素抗性相关,如内环裂解双加氧酶(Intradiol ring-cleavage dioxygenases,ID-ICDs)、丝氨酸蛋白酶(Serine proteases,SPs)、组织蛋白酶L(Cathepsin L)等。2.朱砂叶螨谷氨酸氯离子通道,γ-氨基丁酸氯离子通道基因克隆及其表达模式分析从朱砂叶螨转录组中获得了5条谷氨酸氯离子通道(Glutamate-gated chloride channel,Glu Cls)及3条γ-氨基丁酸氯离子通道(Gamma amino butyric acid-gated chloride channel,GABACls)基因序列,设计特异引物克隆获得了这8条基因c DNA全长(Gene Bank登录号为KT284894-KT284901)。序列比对结果表明,朱砂叶螨8条氯离子通道基因与其它物种的同源基因有着较大的相似性,尤其与其姊妹种二斑叶螨的相似度最高。将朱砂叶螨氯离子通道基因与昆虫GABA氯离子通道、谷氨酸氯离子通道基因以及二斑叶螨基因组测序获得的28条半胱氨酸门控离子通道基因进行进化分析,发现朱砂叶螨GABACls基因和Glu Cls基因均可以与其对应的其它物种中的同源基因分类到同一分支;此外,朱砂叶螨GABA氯离子通道基因与二斑叶螨及其它昆虫的RDL基因(GABACl亚基)亲缘性最近,说明3条GABA氯离子通道基因均属于RDL同源基因,但在朱砂叶螨中未发现有GRD和LCCH同源基因(GABACl亚基)。采用定量PCR技术解析8条氯离子通道基因在朱砂叶螨不同发育阶段的表达模式,结果显示所有基因在卵期的表达量相对最低,在其它螨态之间也略有差异。3.朱砂叶螨氯离子通道基因在爪蟾卵母细胞中的表达使用爪蟾卵母细胞表达系统成功表达了5条Glu Cls和3条GABACls基因。在特异性神经递质(谷氨酸或GABA)的刺激下,卵母细胞出现内向电流,据此明确了基因编码通道蛋白的生理功能。通道蛋白的检测电流与谷氨酸或是GABA灌流呈现出一定的浓度效应,并据此计算5条谷氨酸氯离子通道蛋白的EC50值为Tc Glu Cl2(3.019±0.0354 M)Tc Glu Cl3(2.983±0.0181 M)Tc Glu Cl1(2.884±0.0472 M)Tc Glu Cl4(2.851±0.0340 M)Tc Glu Cl5(2.701±0.0380 M);3条GABA氯离子通道蛋白的EC50值为Tc RDL3(1.086±0.032 M)Tc RDL2(0.677±0.042 M)Tc RDL1(0.445±0.047 M)。4.阿维菌素杀螨作用分子靶标的鉴定通过RNAi技术沉默朱砂叶螨5条Glu Cls基因后,朱砂叶螨对阿维菌素的敏感性下降;同样地,沉默3条GABACls基因后,朱砂叶螨对阿维菌素的敏感性也下降。而电生理学研究表明5条Glu Cls对阿维菌素和伊维菌素均敏感,并且对阿维菌素的电流反应要大于伊维菌素;3条GABACls对阿维菌素和伊维菌素均不敏感。综合电生理研究和RNAi结果表明:朱砂叶螨Glu Cls为阿维菌素和伊维菌素的主要分子靶标,GABACls可能是其作用的次要分子靶标。5.朱砂叶螨靶标抗性机制分析定量PCR技术检测发现8条氯离子通道基因的m RNA表达量在朱砂叶螨敏感及阿维菌素抗性品系中没有显著差异,序列比对分析发现8条基因在朱砂叶螨敏感及阿维菌素抗性品系间不存在氨基酸水平突变。表明在目前抗性水平下,朱砂叶螨对阿维菌素的抗性不涉及这些通道基因的变化。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S482

【参考文献】