山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

发布时间：2018-04-03 16:14

  本文选题：山羊乳腺上皮细胞　切入点：胰岛素诱导基因(INSIG)　出处：《畜牧兽医学报》2016年09期

【摘要】：本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒PmeⅠ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒AdINSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-1)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降(P0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。
[Abstract]:The aim of this study was to construct a recombinant adenovirus Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Adenovirus-Ad@@Therefore, the study of the function of the gene in the regulation of lipid synthesis of goat mammary gland was laid a foundation.According to the goat INSIG1 gene sequence of GenBank (accession number: JQ665439), primers were designed to amplify the CDS region.The target gene was ligated into the shuttle vector pAdTrack-CMV to obtain the pAdTrack-CMV-INSIG1 plasmid. The plasmid Pme I was linearized and transferred into E. coli BJ5183 receptive cells for homologous recombination to obtain pAdEasy-INSIG1 recombinant adenovirus superexpression vector.The recombinant plasmid was linearized by Pac 鈪，

本文编号：1705942