普鲁兰酶基因挖掘、酶学性质及结构域进化研究

发布时间：2018-04-03 20:27

  本文选题：类芽孢杆菌属　切入点：地芽孢杆菌属　出处：《华东理工大学》2016年硕士论文

【摘要】：本研究从7株类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)和地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)菌种中筛选出Paenibacillus lautus (DSMZ 3035),Paenibacillus mucilaginosus (DSMZ24461)和Geobacillus kaustophilus (DSMZ 7263)三株产普鲁兰酶菌株进行下一步实验。首先在筛选培养基上确定了原始菌株普鲁兰酶酶活力,克隆了来源于菌株3035,24461和7263的普鲁兰酶基因(pulPL,pulPM,pulGK),其基因序列大小分别为2355 bp,1965bp和2157 bp。并在NCBI数据库上提交了基因序列,其序列号分别为KT 876382,KT899326和KT 899327。对以上普鲁兰酶保守序列分析可知它们均属于Ⅰ型普鲁兰酶。成功构建重组菌BL21-pET-28a-PulPL,其重组普鲁兰酶3035-28a-PulPL的比活为13.56 U/mg,最适温度为40℃,最适pH为7.0。成功构建重组菌BL21-pET-28a-PulPM,可溶表达重组普鲁兰酶24461-28a-PulPM比活为220 U/mg,最适温度为40℃,最适pH为6.0,在pH 6-9范围内,酶活力较稳定。24461-28a-PulPM酶活力较高,但在高温下酶活损失较大,在45℃的T1/2为9 min。结构域分析发现24461-28a-PulPM与工业化酶2wan的结构相比少一个结构域X45-X25,故而我们将X45-X25拼接至24461-28a-PulPM,并成功构建嵌合酶重组菌BL21-2w-24461-Pul,拼接蛋白含955个氨基酸,最适温度由40℃变为45℃,最适pH由6.0变为7.0,在45℃的T1/2增加了10 mmin。构建重组枯草芽孢杆菌WB800N-pNW-PulGK,分泌重组蛋白7263-pnw-PulGK至发酵液上清中,7263-pnw-PulGK酶活力为5.18 U/mL,其最适温度为65℃,最适pH为6.0,在高温条件下,7263-pnw-PulGK仍能维持大部分酶活。利用海藻酸钠包埋法对7263-pnw-PulGK进行固定化,固定化酶在高温下的耐热性变高,且可使用多次。
[Abstract]:From 7 strains of Bacillus ( Paenibacillus sp . ) and Geobacillus sp . A recombinant strain BL21 - pET - 28a - PulP was successfully constructed . The optimum temperature was 40 鈩，

本文编号：1706781