无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

发布时间：2018-04-03 22:33

  本文选题：Fat-基因　切入点：真核表达载体　出处：《生物工程学报》2016年02期

【摘要】：为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表达载体。体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础。
[Abstract]:In order to establish a sheep cell line with Fat-1 gene without screening marker gene, the Fat-1 gene cloned from PCR was synthesized and cloned into pN1-EGFP frame vector to obtain the pEGFP-N1-Fat-1 eukaryotic expression vector which could delete the screening marker gene.In vitro transcription synthesis of phiC31 integrase mRNA and co-transfection with linearized pEGFP-N1-Fat-1 vector into sheep fetal skin fibroblast cell line G418 were used to screen the expression of green fluorescent monoclonal, and then pET-28a-His-NLS-TAT-Cre plasmid was used to induce the expression of Cre recombinant protein.The purified Cre transduction peptide was transduced into monoclonal cells expressing green fluorescence. The fluorescent quenched cell line was expanded, genomic DNA was extracted and identified by PCR and sequencing. The unlabeled fetal fibroblast cell line of sheep fetal skin with Fat-1 gene was obtained.To lay a foundation for the production of transgenic sheep without screening marker genes.
【作者单位】： 内蒙古农业大学生命科学学院内蒙古自治区生物制造重点实验室;
【基金】：内蒙古生物高科技项目(No.20030301)资助~~
【分类号】：Q78

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本文编号：1707189