大黄鱼Rac、Rab7和Rab5A基因的分子特征与免疫功能的研究

发布时间：2018-04-06 00:39

本文选题：大黄鱼　切入点：免疫刺激　出处：《集美大学》2017年硕士论文

【摘要】：小G蛋白是重要的分子开关,可以调节细胞分裂、细胞骨架形成、囊泡运输、核质运输等多种细胞功能,在免疫中发挥重要作用。本研究克隆得到大黄鱼Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A(分别称为lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A)的cDNA序列,通过与基因组序列图比对获得完整的基因序列,分析了这些基因的分子特征、组织表达特性,以及LPS、PolyI:C、副溶血弧菌等刺激后大黄鱼肝脏、脾脏和肾脏中的表达变化并对利用免疫胶体金技术对肝脏中表达的lycRAC2进行亚细胞定位,利用GSTPulldown和质谱鉴定研究了与lyc RAB5A互作的蛋白质。主要结果如下:1、RAC蛋白包括3个类型,分别为Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全长2329 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac2的cDNA全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac3的cDNA全长2182 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。氨基酸多重比对显示,lycRac1与海龟(Chelonia mydas)、斑马鱼(Maylandia zebra)和红鳍东方渶(Takifugu rubripes)的Rac1基因有高相似性;lycRac2与尖吻鲈(Lates calcarifer)、亚马逊花溕(Poecilia formosa)和剑鱼(Xiphophorus maculatus)同源性高;lycRac3与牛(Bos taurus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)和蓝鲶鱼(Ictalurus furcatus)有较高同源性。通过基因组分析发现lycRac1有6个外显子,5个内含子;lycRac2有7个外显子,6个内含子;lycRac3有7个外显子,6个内含子。进化树分析表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3均与鱼类Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用荧光定量PCR技术检测三个基因在组织中的表达量,发现它们在所有检测的组织中均可以表达,其中,lycRac1在心脏中的表达量最高,血液和脑中也有较高的表达,头肾中的表达量最低;lycRac2在头肾中的表达量最高,肾脏和脾脏中也有较高的表达,肌肉中的表达量最低;lycRac3在血液中的表达量最高,脾脏和脑中也有较高的表达,肠中的表达量最低。大黄鱼受到Lpopolysaccharide,Polyinosinic Polycytidylic acid和Vibrio Parahemolyticus刺激后lycRac1、lycRac2和lycRac3在肝脏、脾脏、头肾中的表达量有不同程度的升高,纯化的lycRAC2蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。免疫电镜结果表明,lycRAC2亚细胞定位于细胞间质。以上结果表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是与免疫相关的基因,它们在应对细菌感染中发挥不可或缺的作用,lycRAC2的亚细胞定位进一步说明lycRac2与信号传递有关。2、Rab7是属于Ras家族的小G蛋白,lycRab7的cDNA全长2218bp,开放阅读框(ORF)624 bp,编码207个氨基酸。氨基酸多重比对结果显示,lycRab7与斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)的Rab7基因同源性较高。通过基因组分析发现,lycRab7有5个外显子,4个内含子。系统进化树分析表明,lycRab7与其它鱼类可以聚成一支。实时荧光定量PCR结果显示,lycRab7在12个组织中均有表达,其中脑中的表达量最高,血液和心脏中也有较高的表达,胃中的表达量最低。大黄鱼受到LPS、polyI:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏和头肾中lycRab7的表达量均明显上调。纯化的lycRAB7蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。以上结果表明,lycRab7在抵御细菌入侵中发挥重要作用。3、Rab5A是Ras家族的一员,已得到纯化的lyc RAB5A蛋白,根据GST pull down结果可知,lycRAB5A蛋白与腺苷三磷酸酶(Calcium-transporting ATPase)、肌酸激酶(Creatine kinase M-type)、肌动蛋白(Actin,alpha skeletal muscle)等蛋白互作。结果表明lycRAB5A与其他蛋白协同在机体免疫中发挥作用。
[Abstract]:The cDNA sequences of lycRac1 , Rac2 , Rac3 , Rab7 and Rab5A ( lycRac1 , lycRac2 , lycRac3 , lycRab7 and lycRab5A ) were sequenced . The results showed that lycRac1 , lycRac2 and lycRac3 were highly expressed in the liver , spleen and head kidney . The results showed that lycRac1 , lycRac2 and lycRac3 were highly expressed in liver , spleen and head kidney . The results showed that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion . The results show that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion . The results show that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion .

【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】