马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

发布时间：2018-04-06 04:37

本文选题：马尔堡病毒　切入点：糖蛋白受体结合域　出处：《中国兽医学报》2017年07期

【摘要】：原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The preparation of rabbit polyclonal antibody is completed , which lays a foundation for the preparation of MARV subunit vaccine and the establishment of antigen and antibody detection method .

【作者单位】：吉林农业大学动物科学技术学院;军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室;吉林大学动物医学学院;东北农业大学动物医学学院;
【基金】：国家科技重大专项(重大新药创制)资助项目(2015ZX09102025)
【分类号】：S852.65

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