p53、线粒体基因多态性与二甲双胍辅助卵巢癌化疗增敏关系研究

发布时间：2018-04-07 15:37

本文选题：卵巢癌　切入点：p53　出处：《郑州大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景卵巢癌因其早期症状不明显、不易发现,造成临床上发现时多为中晚期,并且在化疗过程中一线化疗药物紫杉醇联合卡铂产生的继发耐药时常发生,使得卵巢癌患者的5年生存期较短。在一线化疗药物耐药的情况下,如何有效的预测、减少耐药增敏化疗敏感性成为亟待解决的问题。如何精准的判断个体对一线化疗药物的原发和继发耐药性,为不同的患者提供个性化的治疗方案,增加化疗的敏感性,提高治疗的有效性,研究人员进行了大量的工作。上皮性卵巢癌在卵巢癌中占比超过50%,但由于上皮性卵巢癌的发生发展是一个多基因参与、多因素作用并经过较长时间形成的复杂的过程,因此,目前的研究成果并没有形成很好的理论去阐释卵巢癌的发病、发展和耐药现象。在研究中,越来越多的证据表明,细胞凋亡的改变与铂类药物耐药密切相关。而在细胞凋亡过程中,p53和线粒体起着重要的作用。现有大量的研究表明p53基因改变与铂类药物耐药密切相关,线粒体是p53调控对象和细胞中能量代谢的重要参与者,D-loop区是线粒体最易发生突变的区域,但是将p53和线粒体D-loop区的基因突变与卵巢癌发生、发展、耐药、药物增敏及预后之间关系的研究仍较少。本研究拟对p53基因和线粒体基因组中的D-loop区基因多态性与上皮性卵巢癌发生、发展、耐药、药物增敏及预后之间关系进行研究。在上皮性卵巢癌化疗增敏药物的选择上,虽然许多辅助增强化疗效果的药物被发现,但是大多临床效果仍待时间检验。本研究选取了虽然对卵巢癌化疗增敏效果有争议但在临床上安全使用20余年的廉价、安全药物二甲双胍作为增敏剂进行研究。许多回顾性研究和体外实验研究发现,二甲双胍对乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞株的细胞生长有抑制,但到临床统计中也有学者得出截然相反的结论。这种情况的出现可能与标本的纳入标准及数量有关,也可能与人种、地域差异、细胞株的选择有关。因此,有必要针对不同地域、不同的个体在细胞水平上研究二甲双胍是否可以起到对上皮性卵巢癌化疗的增敏作用,为临床提供理论依据。在实验方案的设计中,考虑卵巢特别是癌变卵巢组织往往取样困难,且几乎不可能在体内二次重复取样;因此,先利用医院保存的上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢组织标本石蜡包埋切片作为研究对象,通过扩增、测序的方法对P53和线粒体D-loop区基因多态性和突变进行分析;在此基础上收集临床病患中上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢组织、组织石蜡包埋切片、病患外周血中游离DNA,研究三者中P53和线粒体D-loop区基因多态性差异。在实验方案设计中,考虑到常规研究中常常采用各种商品化细胞株,其生物学特性与在体内的原代细胞相比发生了较大的变化;因此,本研究将收集到的新鲜组织进行原代培养及有限传代并进行人工耐药驯化,观察不同基因突变耐药情况,以期有助于提高临床上对上皮性卵巢癌患者个性化治疗和预后评估。利用第三代传代细胞进行二甲双胍化疗增敏效果与p53、线粒体基因突变关系的研究。并在此基础上,采用第三代传代细胞注释裸鼠建立移植瘤,观察二甲双胍对不同个体来源移植瘤的影响,为进一步了解P53和线粒体D-loop区基因多态性与上皮性卵巢癌发生、发展、预后的关系提供新的理论依据,为二甲双胍在不同基因多态性上皮性卵巢癌病患中应用提供参考。第一部分p53、线粒体DNA多态性与卵巢癌的关系目的通过对医院临床资料完整明确的河南地区非癌患者卵巢组织和上皮性卵巢癌病人癌变的卵巢组织中p53、D-loop DNA的突变和多态性进行比较,依据测序结果结合临床上继发耐药情况,研究河南地区人群中p53、D-loop的多态性、突变和上皮性卵巢癌发生、耐药的关系,获得潜在的上皮性卵巢癌检测指标和易耐药检测指标。通过对病患外周血、传代细胞、卵巢组织及切片中p53、线粒体基因差异研究,探讨外周血中游离DNA检测卵巢癌及评估耐药性的可能,并对组织切片与实际新鲜组织多态性的差异比较,为临床和后续试验提供依据和借鉴。方法1.卵巢组织切片中p53、线粒体基因的差异研究选取郑州大学第一附属医院(以下简称“郑大一附院”)和濮阳市人民医院收治的在河南生活超过二十年的病患卵巢组织切片作为研究对象。其中60份上皮性卵巢癌组织石蜡标本为首次肿瘤细胞减灭术中收集到的,对照组61例卵巢癌阴性标本为非癌患者卵巢癌组织切片。1.1选取相同厚度的石蜡切片并称量,获取等量石蜡包埋卵巢组织。对这些组织切片中的DNA进行提取、鉴定,比较石蜡包埋组织存放时间对其中DNA提取的质和量的影响。1.2为实现大规模PCR鉴定、测序需要,将传统的PCR条件优化、扩增、鉴定、回收等实验流程优化为以荧光染料进行实时监测的荧光定量PCR,减少操作步骤,避免出错和污染。1.3利用DNAMAN软件将上皮性卵巢癌组织的PCR产物序列、非癌患者卵巢组织标本的PCR产物序列进行比对,如果上皮性卵巢癌组织与非癌患者卵巢组织中的核苷酸序列均为多样化,则为多态性;如果仅表现为上皮性卵巢癌组织的核苷酸序列与非癌患者组织标本不一致,则为突变。2.外周血、传代细胞、卵巢组织及切片中p53、线粒体基因差异研究2.1原代培养与传代:采用红细胞裂解液裂解红细胞,随后用0.3%胶原蛋白酶或联合胰酶在37℃的水浴中反应15min-30min,然后用含10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞并加入细胞瓶中。利用成纤维细胞能迅速贴壁的特点,通过体外培养贴壁时间的差别将组织中的上皮细胞和成纤维细胞进行分离。选取适用于上皮细胞培养的低血清培养M199(SLM)作为后续培养的培养基,并在培养基中添加卵巢上皮细胞促生长因子和防止细菌生长的青链霉素双抗。在细胞长至铺满底部70%左右时用胶原蛋白酶消化并进行传代。2.2基因多态性研究:将患者对外周血、第三代卵巢上皮细胞、新鲜卵巢组织及组织切片四组样本分别提取DNA,采用染料法荧光定量PCR扩增扩增并鉴定后送上海生工测序,测序结果用DNAMAN软件比对。2.2.1通过上皮性卵巢癌患者与非癌患者术前外周血游离DNA的对比,研究外周血游离DNA与上皮性卵巢癌的关系。2.2.2通过比较每个患者的外周血游离DNA、新鲜卵巢组织及卵巢组织切片中基因多态性的差异,研究外周血游离DNA检测代替组织切片检测的可能性以及评估两者和人体卵巢组织基因多态性、检测灵敏度的差异。2.2.3通过对第三代传代细胞和原组织细胞基因多态性的比较,了解细胞传代至第三代时相关基因位点的变化情况。结果1.卵巢组织切片中p53、线粒体基因的差异对121份临床卵巢组织切片进行DNA提取,采用实时荧光定量PCR结合熔解曲线来优化并监控p53和D-loop区基因的PCR。1.1所提取DNA OD260/OD280大都在1.7-2.0之间,且提取量随石蜡包埋组织存放时间的增加而减少。非癌患者组织切片中DNA含量和肿瘤患者组织切片中DNA含量无明显差别。1.2经过多轮的实验优化、验证,确定了p53基因和线粒体DNA的D-loop区基因不同片段在20μL荧光定量PCR体系中扩增的最佳条件。1.3通过测序发现,与非癌患者卵巢p53基因相比,p53基因发现突变位点9个,多态性位点127个。与非癌患者卵巢D-loop基因相比,D-loop区基因发现突变位点11个,多态性位点165个。p53的7号外显子44位密码子由C突变为A可检出阳性标本中的41份,检出率为68.3%;D-loop区73位密码子由A突变为G可检出阳性标本52例,检出率为86.7%,两者联合检测可实现对60份阳性标本的全检出。对于60例上皮性卵巢癌患者中治疗后1年内复发的患者标本进行序列对比、统计、分析,结果显示将Exon4-72G和D-loop309T作为复发标本检测指标进行检测的话,检出率为17/21。如果将Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A联合检测,复发标本检出率21/21,但非复发标本有5份判为阳性。2.外周血、传代细胞、卵巢组织及组织切片中p53、线粒体基因差异2.1非癌患者细胞第一代细胞长满培养瓶底部70%面积平均用时21天,肿瘤细胞平均用时18天。从第二代传至第三代时,非癌患者卵巢细胞铺满培养瓶底部70%面积平均用时15天,肿瘤细胞平均用时12天。采用DAB染色对上述第三代细胞进行了上皮细胞特有表面抗原CK19鉴定,结果显示均为阳性。30例卵巢癌患者中17例卵巢上皮细胞体外培养成功并传至第五代,15例非癌患者卵巢细胞成功培养7例并传至第五代。2.2结果显示:2.2.1非癌患者术前外周血游离DNA含量为7.7±2.6ng/mL,在17份卵巢癌中,2例I期患者含量为26.7±5.4ng/mL;6例II期患者为151±29ng/mL;9例III到IV期患者为234±32ng/mL。上皮性卵巢癌患者外周血中游离DNA含量较非癌患者升高明显。2.2.2新鲜卵巢组织及其石蜡包埋切片对p53基因、D-loop区基因突变位点和多态性位点检测效率一致。外周血中游离DNA检出效率稍差,与前两者相比,有4个p53基因多态性位点、2个D-loop区突变位点及11个D-loop区多态性位点未被检测。但对于p53的7号外显子44位密码子由C突变为A和D-loop区73位密码子由A突变为G两者联合检测,仍可实现对17份阳性标本的全检出。显示出p53的7号外显子44位密码子由C突变为A和D-loop区73位密码子由A突变为G两者联合作为外周血游离DNA检测卵巢癌的潜在可能。2.2.3第三代细胞较原卵巢组织新增p53基因突变位点2个,多态性位点11个,新增D-loop区基因多态性位点4个,提示传代造成了基因的改变。但发现的潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标位点未发生改变,可作为后续细胞水平研究的检测指标。结论选取临床确诊的90例上皮性卵巢癌患者和76例非癌患者的卵巢组织标本作为研究对象,通过对其p53基因、线粒体D-loop区基因的测序,发现了潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标。对其中的45例病患的卵巢组织、组织切片、外周血及传代卵巢上皮细胞标本显示进行进一步研发,发现上皮性卵巢癌患者外周血中游离DNA含量较非癌患者升高明显,石蜡包埋切片和外周血中游离DNA可替代新鲜卵巢组织作为基因多态性检测对象。传代虽然会造成基因的多态性变化,但发现的潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标位点未发生改变,可作为后续细胞水平研究的检测指标。第二部分p53、线粒体基因多态性与二甲双胍在卵巢癌化疗中增敏关系目的利用卵巢细胞体外传代第三代细胞进行耐药驯化,模拟多次化疗耐药的现象,进而观察二甲双胍在紫杉醇、卡铂治疗中的增敏作用。通过检测p53、D-loop基因多态性,研究p53、D-loop基因多态性与卵巢癌耐药、二甲双胍增敏的关系。在动物模型中也采用患者卵巢组织细胞传代第三代细胞建模,并采用非癌患者体血药浓度用药,模拟人在正常用药下二甲双胍对化疗的增敏作用,观察p53、D-loop基因多态性对增敏效果的影响。方法1.二甲双胍在传代卵巢癌细胞中的增敏作用选第一部分第二章成功传代5次的17株癌变卵巢组织的第三代传代细胞作为研究对象,并用SKOV3细胞株作为阳性对照。将每株细胞在稀释为5×105/mL和1×105/mL两个浓度在96孔细胞培养板上各铺48孔。5×105/mL的48孔细胞进行耐药驯化,1×105/mL作为未驯化对照。耐药驯化采用短时间间歇式驯化,并按照耐药驯化所用紫杉醇(0、0.6、1.2μg/mL)、卡铂(0、10、25μg/mL)、二甲双胍(0、0.5、2.5μg/mL)不同水平的组合采用三因素三水平正交实验的方法分为9个组别。在三次驯化后,仍按正交实验组别分别加入驯化时所用药物并培养72h,通过CCK8显色观察对实验组细胞的抑制率,研究二甲双胍在卵巢癌不同化疗中的增敏作用。2.二甲双胍在卵巢癌细胞裸鼠移植瘤中的增敏作用用第一部分第二章成功传代5次的17例癌变卵巢组织的第三代传代细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建卵巢癌裸鼠移植瘤,比较卡铂、紫杉醇联合用药与二甲双胍、卡铂、紫杉醇联合用药效果的差别。以移植瘤直径不小于6mm为建模成功的标准,将各株细胞中建模成功的裸鼠分别随机分为五组:第一组采用生理盐水作为对照;第二组作为低剂量组:二甲双胍400μg/只、紫杉醇80μg/只、卡铂200μg/只;第三组为高剂量组:二甲双胍400μg/只、紫杉醇400μg/只、卡铂1000μg/只;第四组为低剂量对照组:紫杉醇80μg/只、卡铂200μg/只;第五组为高剂量对照组:紫杉醇400μg/只、卡铂1000μg/只。实验结束时对小鼠进行解剖,根据对照组和实验组移植瘤体积的大小比值进行抑制率计算。结果:1.二甲双胍在不同传代卵巢癌细胞中的增敏作用1.1对17株细胞进行耐药驯化,二甲双胍具有明显增敏作用的细胞12株。这12株细胞中9株有化疗耐药倾向。1.2利用Exon6-198G+Exon8-67A+D-loop309T+D-loop446A可在12株增敏作用的细胞中检测出11株,检出率为11/12。利用Exon4-72G+D-loop309T可在12株增敏作用的细胞中检测出8株,均为耐药株,耐药菌株检测率8/9。1.3二甲双胍单独使用,17株肿瘤细胞和7株非癌患者细胞均在72h出现2.72-3.56%不等的抑制,在120h出现3.24-6.83%不等的抑制。二甲双胍对细胞的抑制存在时间依赖,但不随二甲双胍的量改变,提示在这两个人体浓度值范围内,二甲双胍对细胞的抑制效果一致,但长期服用二甲双胍效果会好些。2.二甲双胍在卵巢癌细胞裸鼠移植瘤中的增敏作用17株细胞建模成功13株,最终成瘤大小和数量符合实验要求的9株。裸鼠实验表明,9组中包含细胞培养易耐药细胞5个(S9、S27、S29、S1、S17),其中4个(S27、S29、S1、S17)对铂类有耐药倾向,2个(S9、S27)对紫杉醇有耐药倾向,1个(S9)铂类、紫杉醇联合耐药倾向),紫杉醇、卡铂敏感细胞4个。对于紫杉醇、卡铂联合用药量高低进行比较,无论是否耐药,均存在明显的剂量正相关性。对于各剂量组中添加二甲双胍的对照来看,S11、S6、S19、S26四株对紫杉醇、卡铂敏感细胞中S19、S26表现出对二甲双胍不敏感。其他细胞株的裸鼠实验表明,低剂量的紫杉醇、卡铂在加入口服二甲双胍后对其细胞抑制率增高明显。与细胞水平实验结果一致。结论二甲双胍对卵巢癌耐药细胞具有一定的逆转耐药作用,p53的E7-44A和D-loop区73G两者联合检测出的卵巢癌阳性细胞中具有Exon4-72G、D-loop309T的多态性的容易复发,且对二甲双胍更为敏感,对于Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A基因型的卵巢癌细胞可使用二甲双胍进行增敏。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

【参考文献】