Talen介导的SP110基因定位整合于PRNP基因位点的抗结核、抗瘙痒病羊的研制

发布时间：2018-04-07 16:28

本文选题：结核病　切入点：朊蛋白疾病　出处：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一类危害严重的人畜共患病。结核病的传播和流行对世界农业经济发展、公共卫生健康有着严重的影响。小鼠SP110基因是一种能调节结核病先天免疫力的基因—也称Ipr1基因(intracellular pathogenresistance 1)。大量研究结果显示小鼠SP110基因可有效抑制结核杆菌在巨噬细胞内的繁殖,并且能够控制巨噬细胞的死亡方式。羊搔痒症是朊蛋白类疾病(prion diseases)中的一种,由变异的阮蛋白(PrP)引发,具有传染性与不可治愈性。敲除动物内源性的朊蛋白可抵抗朊病毒的感染,使动物具有抗病性。TALENs靶向基因敲除(敲入)技术是一种较新的分子生物学工具,能够对动植物细胞的基因组进行高效和特异性修饰。本实验旨在通过TALENs基因打靶技术在山羊基因组上朊蛋白基因(PRNP)位点定点插入SP110基因,生产既抗结核病又抗羊瘙痒症的双抗转基因山羊。主要内容有以下几个方面:1 SP110基因在羊巨噬细胞中的功能验证。构建以巨噬细胞特异性启动子调控SP110表达的真核表达载体pGH-SP110,同时设pCDNA3-SP110载体及pCDNA3空载体为对照,将其转染羊肺泡巨噬细胞,并进行体外攻菌试验,荷菌数计数分析攻菌后巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的数量,结果表明转染pGH-SP110真核表达载体的羊肺泡巨噬细胞裂解后释放的活菌数显著低于pCDNA3空载体对照组,说明SP110具有增强巨噬细胞抵抗耻垢分枝杆菌生长和增殖的能力。2.TALENs表达载体的构建与活性鉴定。针对羊13号染色体的PRNP基因位点设计6组特异性的TALENs,构建了 6组表达载体并将其分别转染羊成纤维细胞以检验其切割活性。利用PCR扩增细胞基因组中TALENs靶位点附近序列,通过T7E1核酸内切酶鉴定、BamHⅠ酶切鉴定及TA克隆测序分析6组TALENs载体的基因突变功能,结果表明所设计的6组TALENs中,TALEN-L4/R1的切割活性最高,约为35%。3.靶向 PRNP基因位点的MSR-SP110同源重组载体构建及定位整合细胞株的获得。针对羊13号染色体的PRNP位点设计MSR-SP110打靶载体,PCR分别扩增出PRNP基因第三外显子上的5'同源臂序列和3'同源臂序列,并以Puromycin为正筛选基因,DTA为负筛选基因,构建打靶载体pT-SP110。然后将打靶载体pT-SP110与TALEN-L4/R1共转染30日龄原代山羊胎儿成纤维细胞,经药物筛选共获得102个抗性细胞克隆,通过两轮PCR对其进行基因型鉴定,结果获得了 5个发生同源重组细胞克隆,该位点打靶效率为4.9%。4.体细胞核移植制备克隆羊及其初步分析。以78号定位重组细胞为核供体进行核移植,获得2只怀孕羊。手术分离1只怀孕65d的克隆胎儿用于分析,基因型检测结果显示其PRNP基因位点发生了同源重组(定位敲入SP110基因);RT-PCR检测结果显示该克隆羊朊蛋白基因转录下调、Westem blot检测结果显示该克隆羊内源性阮蛋白表达显著减少,预期可降低对羊瘙痒病的易感性;同时,定位插入的MSR-SP110预期可启动巨噬细胞特异性SP110基因表达,增强巨噬细胞抗菌功能。结论:本研究通过同源重组,在羊PRNP基因位点定位插入了 MSR-SP110表达框,同时敲除了一个PRNP等位基因、降低朊蛋白表达,可增强巨噬细胞对病菌的抵抗力。本研究将会获得既抗结核病,又抗瘙痒症的转基因羊。研究成果不仅对结核病及朊蛋白类疾病的预防与控制有重大意义,也为动物抗病育种和疾病模型研制提供了新思路。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.27;Q78

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