黄秆乌哺鸡竹秆色变异基因（PvLhca1和PvLhca2）的克

发布时间：2018-04-07 17:01

  本文选题：黄秆乌哺鸡竹　切入点：秆色变异　出处：《浙江农林大学》2017年硕士论文

【摘要】：黄秆乌哺鸡竹(Phyllostachys vivax f.aureocaulis)是竹亚科(Bambusoideae Nees)乌哺鸡竹(Phyllostachys vivax McClure)的变型,竹秆为黄色,节间会出现不同宽度和深浅的绿色条纹,也有全绿秆和全黄秆的表型。本课题组利用抑制差减杂交技术构建了全黄秆和全绿秆笋差异表达基因的SSH文库,鉴定了光系统Ⅰ(PSⅠ)中PvLhca1和PvLhca2基因,实时定量RT-PCR分析表明,两个基因在黄秆乌哺鸡竹秆色变异过程中表达量变化显著。为了探究PvLhca1和PvLhca2基因与黄秆乌哺鸡竹秆色变异之间的关系,本课题首先克隆了黄秆乌哺鸡竹PvLhca1和PvLhca2基因cDNA全长序列,通过实时定量RT-PCR技术检测不同发育阶段和不同呈色程度下PvLhca1和PvLhca2基因的表达模式,通过构建植物过表达载体,转化拟南芥探究其基因功能。主要获得的实验结果如下:1.以全绿秆为材料,通过RACE技术克隆了PvLhca1和PvLhca2的cDNA全长,PvLhca1和PvLhca2的cDNA全长分别为741bp和为789bp,分别编码246和262个氨基酸残基的蛋白质。它们有三个典型的α跨膜螺旋。进化树分析表明它们与毛竹(Phyllostachys edulis)中的相应蛋白亲缘关系最近。2.分别采集黄秆乌哺鸡竹全绿与全黄竹笋的四个节间组织:白色、浅绿(浅黄)、淡绿(淡黄)和全绿节间(全黄节间),以及条纹竹笋的三个节间不同条纹区(浅绿、浅黄、淡绿、淡黄、深绿和深黄条纹)。分别刮取节间外表皮,提取RNA,通过实时定量RT-PCR检测发现,相比于绿秆竹笋,在全黄秆竹笋逐渐着色阶段,PvLhca1和PvLhca2基因表达量相对较低,有可能影响叶绿素的积累,调控秆色变化。3.蛋白质是基因功能的体现者,制备PvLhca1和PvLhca2抗体,利用WB(Western Blot)技术检测PvLhca1和PvLhca2在黄色和绿色条纹中的蛋白表达量。结果表明,PvLhca1蛋白产物在浅绿条纹中的表达量明显高于浅黄条纹,与定量RT-PCR结果一致。PvLhca2蛋白产物分子大小高于预测的分子量,推测PvLhca2蛋白产物易与PvLhca3蛋白产物形成二聚体。4.构建植物过表达载体pC1301-PvLhca1和pC1301-PvLhca2,转化拟南芥,PCR和RT-PCR检测表明PvLhca1和PvLhca2整合入拟南芥基因组并转录,转基因植株的叶片平均数分别为28和25片,明显多于野生型拟南芥平均数15片;转基因植株光系统Ⅰ电子传递效率(ETR,electron transport rate)比野生型拟南芥植株明显降低。这些结果说明,过量表达的PvLhca1与PvLhca2降低了光系统I电子传递效率,可能引起植株的吸收光谱发生变化。5.分别克隆了全绿秆与全黄秆PvLhca1和PvLhca2基因的cDNA序列和DNA序列,序列比对表明来源于不同秆色的PvLhca1和PvLhca2基因的cDNA序列无差异。全黄秆中PvLhca1和PvLhca2基因DNA序列均与全绿秆内的基因序列有差异。具体表现为全黄秆中PvLhca1为全绿秆中PvLhca1序列中第二内含子一段序列移动至其第三内含子。全黄秆中PvLhca2基因DNA序列相比于全绿秆中PvLhca2基因缺失了所有的内含子。内含子位置的改变与缺失可能影响了全黄秆中PvLhca1和PvLhca2的表达模式的变化。6.通过基因组步移法,分别克隆PvLhca1和PvLhca2上游调控序列,获得全绿秆中PvLhca1上游调控序列139bp,全黄秆中PvLhca1上游调控序列1121bp;获得全绿秆中PvLhca2基因上游调控序列286bp,全黄秆中PvLhca2基因上游调控序列372bp。现有序列比对得出PvLhca1和PvLhca2基因上游的调控序列黄秆和绿秆中并无差异。通过PlantCARE检测到PvLhca1和PvLhca2上游调控序列中均有温度相关响应元件与光响应元件。总之,本课题克隆了PvLhca1和PvLhca2基因全长序列,转基因结果表明PvLhca1和PvLhca2基因的过表达可能导致光合电子传递效率的降低。相比全绿秆,在全黄秆逐渐着色时期PvLhca1和PvLhca2基因相对表达量低于全绿秆,WB检测同样证明两个基因蛋白产量相对较低,这些表达量的变化可能导致了LHCⅠ不能完美组装,从而影响了全黄秆叶绿素的沉积和秆色的变化。比较了全绿秆和全黄秆间PvLhca1和PvLhca2 DNA序列的不同,发现基因内含子位置的变化和缺失可能影响了PvLhca1和PvLhca2在全黄秆中的表达模式。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S795

【参考文献】

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本文编号：1720060