靶向纳米载体介导基因治疗子宫内膜异位症的疗效及机制研究
本文选题：壳寡糖-硬脂酸嫁接物(CSO-SA) 切入点：理化性质 出处：《浙江大学》2017年博士论文
【摘要】：子宫内膜异位症(endometriosis,EMs,以下简称内异症)是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔以外的身体其它部位,它是一种严重影响妇女身心健康和生活质量的妇科常见病。内异症的发病原因及机理至今仍然不清,其发病率呈逐年上升趋势,在育龄妇女中其发病率几乎超过15%。该病所具有的良性病本质、恶性生物学行为如侵袭、转移、复发等潜能使之成为难以治愈、危害颇大的生殖系统疾病之一。目前临床治疗内异症的方法主要是选择药物和手术治疗,虽能不同程度地缓解症状,缩小病灶,但可能出现明显的不良反应和复发。因此,有必要积极研究内异症的发生机理,探索更优费效关系的治疗内异症手段,才能从根本上解决内异症的主要临床问题。基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的的一种治疗方法。目前人类基因组计划的完成为基因治疗打下了坚实的基础,并将对医药工业产生深远的影响。最新大量研究报道基因治疗可用于肿瘤等难治性疾病,并取得了一定成效。同样我们认为,基因治疗也可用于具有良性病本质和恶性生物学行为的子宫内膜异位症的根本治疗。比如使用siRNA干扰技术静默水通道基因表达,减少或抑制水通道蛋白的表达;再如采用上调PEDF蛋白的表达,抑制新生血管的生成,从而有望成为治疗内异症的新方法。然而,目前基因治疗技术需解决的最大问题之一,是寻找一种安全有效的基因载体递送系统。非病毒载体由于具有制备简单、无免疫原性、且安全性高等优点备受研究者关注。在传递基因方面,最常使用的是阳离子载体,以脂质体和微粒居多,这些研究在不同程度上取得了一些成功,但基因治疗成功率与其数量成正比,必须尽可能多的量传递至细胞质才能获得理想的生物学效应。因此,使携带治疗基因的非病毒载体准确识别靶细胞并在靶细胞中特异表达是治疗的关键。我们根据异位内膜上特异性的受体,对纳米载体表面进行结构上的配体修饰,设计一种高度靶向子宫内膜异位症的新型纳米载体,并使其介导基因作用于内异症大鼠,考察其对大鼠内异症的治疗作用,同时探索新型靶向纳米载体介导基因治疗内异症的安全性和可能机制,为最终用于临床治疗内异症,改善现有药物与手术方案疗效不佳的问题提供新思路、新方法。第一部分靶向纳米给药系统的制备及其体外性质研究目的:筛选并优化靶向纳米给药系统。方法:以碳二亚胺法制备壳寡糖-硬脂酸嫁接物(CSO-SA)。采用芘荧光法测定嫁接物在水中的临界胶团浓度,采用三硝基苯磺酸法测定氨基取代度。采用质粒DNA(PEDF)作为报告基因,制备CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统。透射电子显微镜观察其表面形态,微粒粒度与表面电位测定仪测定CSO-SA/PEDF纳米给药系统粒径与表面电位,凝胶阻滞分析考察CSO-SA与PEDF间的密接程度,研究CSO-S A/PEDF基因纳米给药系统的生物稳定性,MTT法测定细胞毒性。结果:采用化学嫁接方法,得到CSO-SA,氨基取代度为13%,其在水中的临界胶团浓度为0.025 mg · mL-1。当N/P为9.6时,CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统的粒径为135.6nm,电位为6.4±0.1mV。透射电子显微镜观察发现CSO-SA/PEDF纳米给药系统大小均匀,呈球形。体外细胞实验显示细胞毒性明显小于脂质体,转染效率高。结论:初步显示了这种新型的基因载体高效低毒的特性。第二部分靶向纳米载体介导PEDF治疗子宫内膜异位症的疗效及机制研究目的:为了减少子宫内膜异位症药物治疗引起的副作用,改善临床治疗对策,设计研究CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统治疗子宫内膜异位症的可行性,并初步探索机制。方法:采用第一部分内容制备的CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统,尾静脉注射后考察CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统在子宫内膜异位症模型大鼠中的分布情况;经CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统治疗一个疗程后(2周),观察其对异位病灶的影响,考察异位病灶细胞凋亡、微血管密度、VEGF表达等各项指标的变化。电子显微镜法观察CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统对生殖器官是否有不良反应。结果:PEDF由CSO-SA介导后可分布到子宫内膜异位症模型大鼠的异位病灶组织。CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统的治疗可引起子宫内膜异位病灶缩小,使异位子宫内膜明显萎缩,微血管密度明显降低。CSO-SA/PEDF治疗组的子宫内膜异位病灶细胞凋亡指数显着增加。但CSO-SA/PEDF治疗组的子宫和卵巢组织的病理形态学未见明显异常,超微结构观察亦未见明显异常。结论:CSO-SA/PEDF基因纳米给药系统可用作子宫内膜异位症的有效治疗方法。第三部分特异性靶向纳米载体介导AQP2-siRNA治疗子宫内膜异位症的疗效及机制研究目的:为研究新的治疗子宫内膜异位症的方法,构建特异性靶向纳米载体,并研究特异性靶向纳米载体介导AQP2-siRNA治疗内异症的疗效及可能机制。方法:化学合成法制备壳寡糖-聚乙烯亚胺复合物(Polyethylenimine grafted chitosan oligosaccharide,CSO-PEI)。通过正负电吸附原理构建AQP2-siRNA基因纳米给药系统,并根据基因浓度制备不同N/P的基因纳米给药系统。通过共同孵育的方法物理包裹透明质酸(hyaluronic acid,HA)。凝胶阻滞分析考察阳离子嫁接物与AQP2-siRNA的密接程度,研究纳米给药系统的生物稳定性。原子力显微镜观察其表面形态,微粒粒度与表面电位测定仪测定(CSO-PEI/siRNA)HA纳米给药系统粒径与表面电位,MTT法测定细胞毒性。荧光嫁接法(FITC)考察细胞摄取情况,在体荧光显微镜法观察基因纳米给药系统在模型动物体内的分布。尾静脉注射(CSO-PEI/siRNA)HA纳米给药系统和生理盐水,治疗一个疗程后观察其对大鼠子宫内膜异位症病灶大小的影响和病理学形态变化。直观比较子宫内膜异位症病灶凋亡、内异组织CD44表达情况、微血管密度变化等各项指标,分析(CSO-PEI/siRNA)HA对异位病灶细胞的促凋亡作用,考察(CSO-PEI/siRNA)HA对新生血管生成的抑制作用,透射电子显微镜法观察(CSO-PEI/siRNA)HA对模型大鼠子宫、卵巢等生殖器官脏器是否有不良反应。结果:1.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统物理稳定性好,形态分布均匀。2.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统细胞毒性小,摄取能力强。3.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统可通过HA配体特异性靶向内异细胞 CD44。4.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统在体内子宫内膜囊肿部位的分布明显高于对照组。5.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统治疗组可使异位病灶大小明显缩小,异位子宫内膜出现明显的萎缩迹象。6.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统治疗组的血管密度显著降低。7.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统治疗组异位病灶细胞凋亡指数显著高于对照组。8.(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统治疗组对生殖器官脏器无明显不良反应。9.内异组织中的CD44表达量明显高于正常内膜组织中的表达;当(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统治疗后CD44表达量明显降低。结论:(CSO-PEI/siRNA)HA基因纳米给药系统可以治疗大鼠子宫内膜异位症,并未见明显副作用。治疗作用可能的机制是通过特异性靶向内异组织部位,抑制异位病灶的新生血管的生成,促进异位子宫内膜细胞的凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.71;R450
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本文编号：1725785
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