粗糙型猪霍乱沙门菌与鼠伤寒沙门菌rfaJ基因缺失株的构建及其生物学特性研究

发布时间：2018-04-10 00:02

本文选题：猪霍乱沙门菌C500　切入点：鼠伤寒沙门菌D6　出处：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：食品安全是一重要的社会民生问题,猪肉是人类主要的动物食品,但猪及其制品易受沙门菌感染,威胁着食品安全及人类健康。猪霍乱沙门菌为宿主适应性沙门菌,易引起2-4月龄仔猪副伤寒病,发病死亡率较高,对养猪业中有着严重的危害。同时,鼠伤寒沙门菌作为沙门菌最常见血清型,其动物宿主广泛,包括猪,是重要的食源性病原菌之一,也是人类食物中毒主要原因。实践证明,疫苗是防控猪沙门菌病的有效措施之一。猪霍乱沙门菌C500株已经作为减毒疫苗使用40余年,该疫苗可从动物饲养源头控制沙门菌对动物的感染和侵害,能有效预防仔猪副伤寒,并减少沙门菌对肉产品的污染,从而减少沙门菌通过食物链感染人类,阻断沙门菌人畜之间传播,防止沙门菌病的发生。该疫苗在疾病防控中发挥重大作用,但遗憾的是动物接种该疫苗后不能通过基于玻板凝集的试验方法,简单快速鉴别动物是被免疫还是被感染(Differentiating Infected from Vaccinated Animals,DIVA)。为此,本研究构建猪霍乱沙门菌的LPS相关基因rfaJ缺失株,致力于区分免疫动物和自然感染动物。另外,还构建了鼠伤寒沙门菌D6的rfaJ缺失株,并对它们生物学特性和免疫保护进行了评价,初步探索了rfaJ基因在DIVA疫苗设计及其鉴别诊断中的应用潜能。1.猪霍乱沙门菌rfaJ基因缺失株的构建及其生物学特性研究本研究利用λ-red同源重组方法构建了猪霍乱沙门菌C500?rfaJ缺失株,测序和PCR鉴定结果表明,rfaJ基因从基因组中缺失,同时构建了回复株C500?rfaJ::rfaJ。缺失株C500?rfaJ的生长速度与野生株C500相比无明显变化,液体培养缺失株C500?rfaJ易发生自凝集沉淀现象。与亲本株C500相比,缺失株LPS结构因O抗原缺失而不再完整,细菌由光滑型变为粗糙型。C500?rfaJ免疫后的小鼠血清不与亲本株C500发生凝集,能够区分感染动物和免疫动物的血清。缺失株C500?rfaJ感染猪空肠上皮细胞IPEC-J2后,缺失株C500?rfaJ对细胞的黏附和侵染能力有明显下降(P0.01),其在细胞内增殖能力无显著变化。荧光定量PCR方法检测C500?rfaJ刺激细胞后细胞炎性因子mRNA表达水平,结果显示,与亲本株C500感染细胞组相比,TNF-α、IL-4与IL-6表达水平明显下降。2.鼠伤寒沙门菌rfaJ基因缺失株的构建及其生物学特性研究以鼠伤寒沙门菌D6为研究对象,构建了 D6?rfaJ基因缺失株及其回复株D6?rfaJ::rfaJ。鼠伤寒沙门菌D6?rfaJ基因缺失株生物特性与猪霍乱沙门菌缺失株C500?ArfaJ的生物特性基本一致。缺失株D6?rfaJ生长速度与野生株相比无明显变化,液体培养过程中缺失株发生自凝集沉淀;与其亲本株D6相比较,D6?rfaJ的LPS结构因O抗原缺失不再完整,细菌由光滑型变为粗糙型,D6?rfaJ免疫后的小鼠血清不与其亲本株D6发生凝集。然而,有些生物学特性发生了改变,多项生化指标发生改变,缺失株运动能力下降。以缺失株D6?rfaJ和亲本株D6分别感染猪空肠上皮细胞IPEC-J2后发现,缺失株D6?rfaJ对细胞的黏附和侵染能力有明显下降,但增殖能力无特别明显变化,并在感染8h后缺失株的增殖能力超过亲本株D6;以BALB/c为动物模型,口服途径免疫6周龄小鼠,间隔2周,再次免疫,2周后以口服途径攻毒,对D6?rfaJ进行了免疫保护效力评价,结果显示,血清中抗体水平在14d时达到较高水平,并且小鼠经2次免疫后两周,能够对高毒力菌株SL1344提供80%的免疫保护;缺失株D6?rfaJ在体内脏器和粪便中的带菌时间低于亲本株D6在体内存在时间;口服细菌后,相比较亲本株D6,缺失株感染组小鼠脏器的病理切片无明显病灶。综上所述,D6?rfaJ不仅具有良好的安全性,同时能提供良好的免疫保护力,为鼠伤寒沙门菌DIVA疫苗设计奠定重要的基础。
[Abstract]:Salmonella typhimurium C500 strain has been used as one of the most common serotypes of Salmonella . It has been proved that the vaccine is one of the most common serotypes of Salmonella . It has been proved that the vaccine is one of the most common serotypes of Salmonella . It has been proved that the vaccine is one of the most important food - borne pathogens . The rfaJ gene deletion strain of Salmonella typhimurium strain C500 脳 rfaJ was constructed and its biological characteristics were evaluated . The results showed that the growth rate of rfaJ gene deleted strain C500 脳 rfaJ was significantly decreased compared with the parent strain C500 ? rfaJ . In conclusion , D6 ? rfaJ not only has good safety , but also provides good immune protection force , which lays an important foundation for the design of DIVA vaccine for Salmonella typhimurium .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

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