三疣梭子蟹Toll、HMGB家族基因在先天免疫中的功能研究

发布时间：2018-04-11 07:23

本文选题：三疣梭子蟹 + 转录组　；参考：《上海海洋大学》2017年硕士论文

【摘要】：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物,在中国、朝鲜、日本等海域均有分布,我国黄渤海及东海分布尤为广泛。随着养殖规模不断扩大,累代养殖造成种质退化,病害问题也日趋严重,给三疣梭子蟹养殖业造成了巨大经济损失。其中,白斑综合征病毒(WSSV)以及弧菌等病原均会造成三疣梭子蟹组织病变乃至死亡。此外,作为一种重要的水体环境因子,盐度也会对三疣梭子蟹等甲壳动物的免疫能力产生较大影响。三疣梭子蟹等无脊椎动物不具有获得性免疫,但可以依赖机体自身独特的先天免疫系统,通过一系列免疫信号通路级联反应,抵御入侵机体的病原微生物。有鉴于此,本研究利用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)对三疣梭子蟹进行感染并取其血细胞进行转录组测序,筛选出免疫相关基因;以副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和WSSV作为病原对三疣梭子蟹进行注射感染,并通过低盐胁迫实验,对三疣梭子蟹先天免疫相关基因的功能进行初步研究,为深入开展三疣梭子蟹等甲壳动物病害防御机制奠定基础,为有效解决养殖产业中出现的病害问题提供理论支持。本论文的主要内容如下:1.三疣梭子蟹感染溶藻弧菌转录组分析及免疫基因发掘溶藻弧菌作为三疣梭子蟹易感弧菌之一,会在宿主体内增殖,造成机体细胞和组织损伤,引发“乳化病”等病害,严重威胁养殖产业的发展。然而三疣梭子蟹等甲壳动物具有独特的先天免疫系统,可以有效抵御、清除外来病原。本研究取三疣梭子蟹感染溶藻弧菌12 h血细胞和对照组血细胞进行转录组测序,经Trinity拼接共获得75576条Unigene序列,其中63515条Unigenes得到注释。GO功能注释结果表明,共有14848条unigenes被分类到生物过程、细胞组分和分子功能三大类别中,其中生物过程主要涉及生物调节、细胞过程、单生物进程、代谢过程、应激反应和免疫防御等。共有7130条unigenes被分类到KEGG代谢通路的5个分支,主要涉及信号转导、翻译、运输、分解代谢、免疫系统相关的信号通路。通过比较感染组和对照组转录组测序结果,共筛选出791个差异表达基因,其中上调表达的有453个,下调表达的有338个。通过对GO、KEGG富集和差异基因的分析,确定Toll样受体基因和HMGB家族基因作为本次研究的免疫基因。此外,利用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹并进行高通量测序,有助于进一步探索其致病机理,并为三疣梭子蟹疾病防御及组学分析提供基础数据。2.三疣梭子蟹Toll家族基因的克隆与表达分析三疣梭子蟹等无脊椎动物先天免疫主要是由胚系基因所编码的模式识别受体所介导,Toll样受体便是一种重要的模式识别受体。本研究采用RACE技术克隆得到了三疣梭子蟹Toll样受体家族中的2个新基因,分别命名为Pt Toll4和Pt Toll5。其中,Pt Toll4基因c DNA全长4276 bp,包含2685 bp的开放阅读框(ORF),编码一个含有895个氨基酸,分子量102.5 k D,理论等电点6.03的蛋白质;Pt Toll5基因c DNA全长4914 bp,包含4083 bp的开放阅读框(ORF),编码一个含有1361个氨基酸,分子量151.6 k D,理论等电点5.69的蛋白质。Pt Toll4、Pt Toll5蛋白均具有典型的Toll家族结构域,是I型跨膜蛋白,存在胞外LRR结构域(其中Pt Toll4包含LRRCT结构,Pt Toll5包含LRRNT结构)及保守的胞内区TIR结构域。同源分析表明Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹Es Toll2的同源性最高,为61%;Pt Toll5氨基酸序列与罗氏沼虾Mr Toll的同源性最高,为75%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,而Pt Toll5在眼柄中的表达量最高,在血细胞中的表达量最低。利用副溶血弧菌和WSSV对三疣梭子蟹进行注射感染,结果表明,经WSSV感染后Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。经WSSV感染后,Pt Toll5基因在血细胞中出现了整体的表达下调,48 h达到了表达量的最低值,为对照组的0.27倍(P0.05)。经WSSV感染后,Pt Toll5基因在血细胞中同样出现了表达下调现象,48 h出现了表达量的最低值,为对照组的0.53倍(P0.05)。由此我们推测Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能,而Pt Toll5的下调表达可能也会造成三疣梭子蟹免疫力下降。此外发现低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4、Pt Toll5基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫能力下降的原因之一。对Pt Toll5中发现的SNP位点进行抗病能力关联分析,结果表明未能有效关联。综上分析,Pt Toll4、Pt Toll5基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,并为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。3.三疣梭子蟹HMGB家族基因的克隆与表达分析高迁移率族蛋白B(high-mobility group box protein,HMGB)是一种典型的HMG家族蛋白,在调节DNA重组、修复、复制和基因转录方面均起着重要作用。近来研究发现,脊椎动物中的HMGB1可由凋亡细胞或经IL-1β等炎症因子激活的细胞释放到细胞外并与先天免疫信号通路TLR家族中的TLR2、TLR4、TLR9等受体结合,调节多种免疫炎症反应。为研究三疣梭子HMGB家族基因在先天免疫中发挥的功能,本实验利用RACE技术首次克隆得到了2个三疣梭子蟹HMGB基因,分别命名为Pt HMGBa、Pt HMGBb。其中,Pt HMGBa基因c DNA序列全长1030bp,开放阅读框(ORF)为681bp,编码了一个含有227个氨基酸,分子量25.82 k D,理论等电点为5.94的蛋白质。Pt HMGBb基因c DNA序列全长981bp,开放阅读框(ORF)为618 bp,编码了一个含有206个氨基酸,分子量24.07 k D,理论等电点为6.28的蛋白质。Pt HMGBa和Pt HMGBb蛋白均包含两个HMG盒结构域和一个酸性尾部结构域,符合HMGB家族蛋白的典型特征。同源分析分析表明,Pt HMGBa和Pt HMGBb氨基酸序列分别与凡纳滨对虾Lv HMGBa和Lv HMGBb相似度最高。实时荧光定量PCR结果显示,Pt HMGBa、Pt HMGBb基因均在血细胞的表达量最高。利用副溶血弧菌和WSSV对三疣梭子蟹进行注射感染,结果表明,Pt HMGBa基因经副溶血弧菌感染6 h后出现显著上调且出现表达量的峰值,为对照组的3.5倍(P0.05),经WSSV后,Pt HMGBa于12 h出现显著上调且达到对照组的2.3倍(P0.05);经副溶血弧菌感染后,Pt HMGBb基因在三疣梭子蟹血细胞中,于24 h达到表达量的峰值,为对照组的2.5倍(P0.05),经WSSV感染后,Pt HMGBb在12 h达到峰值,表达量达到了对照组的5.2倍(P0.05)。由此可知Pt HMGBa、Pt HMGBb在不同病原入侵后都会被诱导表达。而经低盐胁迫后,表达量会被严重抑制,从而可能影响机体的先天免疫能力,根据以上结果推测Pt HMGBa、Pt HMGBb基因均参与了三疣梭子蟹抵御外来病原的免疫响应,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了有力证据。
[Abstract]:Portunus trituberculatus ( Portunus trituberculatus ) is an important marine economic animal , which is widely distributed in China , North Korea , Japan and other sea areas . The expression of Toll - like receptor gene and HMGB family gene were identified by RACE technique . The results showed that the expression of Pt Toll4 gene in blood cells increased significantly after infection . The results showed that the expression of Pt Toll4 gene was down - regulated in blood cells . The results showed that Pt HMGBa and Pt HMGBb had the highest expression level after 6 h . The results showed that Pt HMGBa and Pt HMGBb had the highest expression level after 6 h .

【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S945

【参考文献】