MiR-708通过靶基因SMAD3抑制间充质干细胞成骨分化并促进激素性股骨头坏死

发布时间：2018-04-11 14:31

  本文选题：激素性股骨头坏死 + 骨髓间充质干细胞　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：分离、培养与鉴定骨髓间充质干细胞,研究糖皮质激素对MSCs成骨成脂分化的影响,寻找激素性股骨头坏死患者MSCs中具有显著差异表达的miRNA。方法：依据纳入条件建立样品池,通过常规方法分离、培养MSCs,并用流式细胞技术做免疫表型鉴定。分别用成骨、成脂诱导分化培养基培养激素组与对照组MSCs,14天后分别行茜素红S及油红O染色,显微镜下观察细胞染色程度。将激素组与对照组MSCs的总RNA提取后,进行富集与标记,再与miRNA芯片Asymetrix 3.0杂交,摄取荧光图像后进行一系列软件数据分析,最终得到差异表达的miRNA。结果：成功获得了样品并分组,成功分离、培养了MSCs,流式细胞学表型分析结果显示出我们的细胞一致阳性表达CD29与CD44表型,而均阴性表达人造血细胞系表型CD34与CD45。诱导分化与染色结果可见激素性股骨头坏死患者的MSCs相比于对照组MSCs,其成骨分化能力受到抑制而成脂分化能力加强。芯片微阵列分析最终筛选出了2个在实验组中表达显著升高的miRNA, miR-483-5p与miR-708,以及6个在实验组中表达显著降低的miRNA, miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b以进行后续研究。结论：我们所获得的细胞是人骨髓间充质干细胞,激素抑制了MSCs成骨分化而促进了成脂分化。激素的使用可能导致了MSCs中miR-483-5p与miR-708表达增加,miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b表达降低。目的：掌握miRNA相关实时定量PCR技术,并通过此技术进一步验证微阵列分析初筛后的8个miRNA的表达变化情况,以选出其中结果稳定且表达差异显著的miRNA以进行后续研究。方法：选取另外的3组激素组与对照组患者MSCs (GCs 4-6 and Con 4-6)直接进行PCR检测观察8个miRNA (miR-483-5p, miR-708, miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b)的表达水平变化。此外我们还设计了一项体外梯度浓度地塞米松(0 M、10-8M、10-7M和10-6M)干预MSCs的实验,观察直接激素干预对MSCs内这些miRNA表达水平的影响。结果：激素性股骨头坏死患者的MSCs相对于对照组患者的MSCs,其miR-25, miR-92a-1, miR-708和miR-483-5p的表达具有显著性差异(p0.05)。经梯度浓度Dex干预后MSCs中miR-708和miR-483-5p的表达变化与此前的芯片微阵列分析结果和上述实时定量PCR验证结果一致,且具有显著性差异,并且激素介导的miR-708表达变化呈现出明显的剂量相关性。此外miR-25和miR-20b的表达仅在10-6M地塞米松浓度时有显著下降。结论：结合本册第一部分的芯片微阵列分析,本次实时定量PCR验证和体外梯度浓度地塞米松干预实验,都一致地显示出在体内和体外只有miR-708在糖皮质激素的作用下表达水平显著升高。因miR-708在以上这些结果中稳定而显著的差异表达情况,我们将其视为被选中的miRNA来进行后续的作用靶点确认和细胞功能分析研究。目的：掌握生物信息学、miRNA转染、双荧光素酶报告基因等实验技术,探寻miR-708的靶基因,阐述激素的使用影响MSCs成骨分化并最终导致激素性股骨头坏死的机制。方法：使用诸多在线软件工具预测miR-708可能的作用靶点,使用MAS 3.0软件系统中的Gene Ontology (GO) terms和KEGG pathway分析这些被预测的靶基因在生物学过程和细胞内信号转导通路中的相关性。选定可能的靶点后,通过转染上调MSCs中miR-708,并使用PCR及Western blot检测靶基因与下游基因的表达水平变化。使用双荧光素酶法验证miR-708靶向并直接抑制所预测的靶基因的表达。转染下调GC-MSC中miR-708并同样观察相关基因蛋白的表达及随后MSCs成骨成脂功能的变化。结果：SMAD3与SMAD4被预测为miR-708可能的作用靶点。评价我们的转染效果证实良好。通过转染.上调miR-708抑制了普通MSCs中SMAD3与RUNX2的表达。双荧光素酶报告基因检测证实SMAD3为miR-708的直接作用靶点。通过转染下调miR-708恢复了激素组MSCs的成骨分化能力,并增加了SMAD3的表达。结论：MiR-708以SMAD3为靶基因,因激素作用而上调的miR-708直接抑制了MSCs中SMAD3的表达,SMAD3基因的变化可能间接通过TGF-beta signaling等一系列细胞内信号转导作用影响了MSCs成骨分化重要基因RUNX2的表达水平,最终导致了MSCs成骨分化能力的下降,促进了激素性股骨头坏死的发生与发展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.8

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本文编号：1736386