维吉尼亚链霉菌IBL14中CYP105家族基因生理功能和甾醇类定向转化机理研究

发布时间：2018-04-13 07:32

本文选题：CRISPR-Cas系统 + CYP105　；参考：《安徽大学》2017年博士论文

【摘要】：维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomycesvirginiae IBL14)是一株从甾体药物制药厂排污池土壤中分离得到的放线菌。该菌株能在多种留醇类化合物(包括薯蓣皂素、雌二醇、去氧皮质酮、胆固醇、麦角固醇等)为唯一碳源的培养基上进行生长,并且能通过次级代谢产生多种新的甾醇类化合物。为系统阐明该菌株CPY在复杂的次级代谢过程中的功能与机理,实验室已对S.virginiaeIBL14进行了全基因组测序,并利用G0、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG等数据库对获得的全基因组数据进行了基因分析与功能注释。本论文旨在对该染色体中的CYP105家族基因进行信息学分析预测、基因敲除、蛋白表达、生物转化及结构与功能分析。S.virginniae IBL14全基因组的生物信息学分析发现:该菌株含有31个CYP450 基因,其中:svh001、svu001、svu003、svu004、sVu005 为 CYP105 家族基因,svh001、svu003、svu004具有极高的同源性,其二级结构基本相同,推测三个基因在结构和功能上是极其保守的,可能具有类似的功能。sVu005基因和svh001、svu003、sVu004具有一定的二级结构差异。svu001其氨基酸和其它CYP105同源性较低,但在二维结构上,和其他CYP105家族基因没有明显区别,均含有13个α超螺旋结构;svu001和其它CYP105家族基因二维结构主要的区别在于其α螺旋均比同家族基因长,导致其蛋白总长高达499个AA(一般为400个左右)。在CYP105家族基因的五个基因中,均发现了 K-helix和Heme binding motif 保守基序。svh001、svu003、svu004、svu005 的 Heme binding motif 极为保守,尤其是svu003、svu004的Heme binding motif完全一致;但与svu001的Heme binding motif有极大的差异。这五个基因的K-helix基序基本一致。而所有CYP家族中被认为是一个保守的I-helix基序,却未在svu001发现。通过基因注释、序列比对和系统进化树的分析,我们确定svh001、svu003、svu004为CYP105C1;svu005为CYP105D1;svu00l因具有不同寻常的特征,认为其为CYP105家族中的一个新的亚家族或者是一个新的家族基因。全基因组的生物信息学分析还发现:S.virginiae IBL14基因组存在着一个CRISPR-Cas基因编辑系统。对该系统Cas蛋白的组成及排列结构分析,我们将其命名其为Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系统。实验证明该系统能高效的对自身基因组中的基因进行编辑;特别是应用该系统开发的基因编辑工具可对其它生物进行有效的基因编辑,具有替代目前商用的Cas9基因编辑系统的潜力。实验中,我们设计并构建了包含编辑模板片段(templet DNA/t-DNA)和靶向基因片段(guide DNA/g-DNA)的基因编辑质粒(gene editing plasmid),并将其转化到S.virginiae IBL14原生质体中,筛选得到上述5个CYP105家族基因敲除的转化子。结合唯一碳源生长、生理形态分析、生物信息学分析等方法研究了CYP105家族基因对S.virginiae IBL14生理功能的影响,结果表明:1)Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系统可以成功对该基因组内源基因进行编辑,其操作简单、耗时短、效率高;2)CYP105家族基因的单敲除不致死,但会明显影响菌体的生长和生理变化,其中IBL14Asvu004在液体和固体培养时大量产生胞内色素,并且在液体培养时不形成菌丝球;3)S.virginiea IBL14复杂的次级代谢产物可以有效地抑制细菌和真菌的生长;4)CYP105基因的敲除通过影响聚酮的代谢途径显著影响IBL14的抗生素和抗真菌素的生产。实验将CYP105家族基因在大肠杆菌中成功地进行了克隆,优化了发酵条件,实现了可溶性的外源表达。并以多种留醇类化合物作为底物,进行了生物转化功能分析。试验表明:(1)svh001具有多种甾醇类物质生物转化功能:轻化雌二醇生成雌三醇,轻化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,轻化16,17环氧黄体酮生成新的轻化产物。(2)svu001可以轻化雌二醇生成雌三醇,轻化维生素D3生成25-轻基维生素D3,其所在基因簇与精氨酸代谢途径相关,可以羟化精氨酸为N-ω-羟基-精氨酸。(3)svu003可以轻化雌二醇生成雌三醇,轻化维生素D3生成25-羟基-维生素D3。(4)svu004可以轻化雌二醇生成雌三醇和2要基雌二醇,轻化维生素D3生成25.轻基.维生素D3,羟化16,17环氧黄体酮生成新的轻化产物(不同于svh001)。(5)svu005可以轻化雌二醇生成雌三醇,轻化雄烯二酮生成9位轻基化产物,以及将二苯甲酮轻化为4-羟基二苯甲酮。(6)CYP105家族的三个C家族基因的表达蛋白在多种底物代谢中表现出一定的共性,但D家族的svu005基因表达蛋白具有相对独立的底物域。本研究揭示维吉尼亚链霉菌IBL14的CYP105基因的亚家族定位与进化关系,探索了 CYP105家族基因的底物域,加深了羟化反应的分子机理的理解。本研究的结果有助于改造、合成新的轻化酶,提高酶的反应活力与环境适应能力;在甾醇类物质的特定位点、特定立体构象引入轻基,生产全新的甾体药物及药物中间体;促进对甾体污染物的转化与降解。
[Abstract]:In order to clarify the function and mechanism of the CYP105 family gene in the complex secondary metabolic process , it is found that the two - dimensional structure of the CYP105 family gene is very conservative and has a similar function . The two - dimensional structure of svu001 , svu001 , svu003 , svu004 , svu003 and svu004 has a very high homology . In this paper , we identified svh001 , svu003 , svu004 as CYP105C1 , svu005 as a new subfamily of CYP105 family or a new family gene . ( 4 ) The gene cluster of CYP105 family has been successfully cloned in E . coli .

【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93;Q78

【相似文献】