恶性肿瘤功能基因分析方法的应用研究

发布时间：2018-04-13 13:39

  本文选题：卵巢癌 + 乳腺癌　； 参考：《扬州大学》2016年博士论文

【摘要】：随着分子生物学、细胞生物学和生命分析化学的发展, “后基因组时代”功能基因组学的研究不断深入,越来越多的促进肿瘤发生发展的基因被人类所认识。本论文围绕肿瘤基因功能的甄定、基因表达水平的检测、基因促进肿瘤细胞生长的规律等方面开展研究。1.人卵巢癌组织中UHRF1基因检测与分析化学合成针对UHRF1基因的siRNA或shRNA干扰片段,将其转入卵巢癌细胞株SKOV-3、OVCAR-3、HO-8910和HO-8910 PM,抑制其在细胞株中的表达,探索UHRF1基因在卵巢癌细胞中的生物学功能。采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot验证RNAi的沉默效果；CCK-8试验检测UHRF1基因沉默前后细胞增殖水平的变化。流式细胞术和Hoechst33342检测细胞的凋亡水平。Transwell小室试验检测细胞的侵袭能力。用Western blot技术检测HO-8910和HO-8910 PM细胞周期蛋白Cyclin D2, Cyclin E, Cyclin B1的表达。用流式细胞术检测HO-8910和HO-8910 PM细胞株UHRF1基因沉默前后细胞周期分布的变化情况。结果发现,抑制UHRF1基因在卵巢癌细胞中的表达,细胞的生长能力和侵袭能力减弱,细胞凋亡增加；UHRF1敲减后,HO-8910细胞发生了G2/M期阻滞,Cyclin B1蛋白的表达增加。该研究表明UHRF1基因是促进肿瘤细胞生长的功能癌基因。2.卵巢癌细胞株UHRF1基因功能分析方法的应用研究应用RT-PCR和Western-blot技术,研究UHRF1在卵巢癌组织中的表达。采用免疫组织化学方法,检测上皮性卵巢癌良性肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中UHRF1阳性表达并分析其与患者的年龄、卵巢癌临床分期、细胞分化及淋巴结转移的关系,为卵巢癌的诊疗和评估预后提供理论依据。RT-PCR和Western blot结果显示,UHRF1 mRNA和蛋白在卵巢癌组织中的表达高于对应的癌旁组织(P0.01；P0.05)；免疫组织化学结果显示,卵巢癌良性肿瘤组织中UHRF1表达阳性率为6.67%(1/15),卵巢癌组织中阳性率为42.86%(24/56)。卵巢癌组织中UHRF1阳性率高于卵巢良性肿瘤组织,差异有统计学意义(P0.05)；分析56例石蜡包埋卵巢癌组织块的临床病理资料发现,UHRF1的表达与卵巢癌的分级有关(P0.05),而与患者的年龄、肿块的大小以及肿瘤的分期和淋巴结是否转移无关(P0.05)。结果提示UHRF1基因有望发展成为新的肿瘤标志物。3.乳腺癌细胞株周期蛋白Cyclin Y检测分析细胞周期蛋白Cyclin Y(CCNY)能够与肿瘤相关基因PFTK1相互作用,调节肿瘤细胞的生长。本论文分析了65例乳腺癌组织和4株乳腺癌细胞系BT-474, MDA-MB-231, T-47D and MCF-7由CCNY的表达水平。应用慢病毒介导的ShRNA抑制细胞周期蛋白Y在两种乳腺癌细胞mda-mb-231和MCF-7中的表达。MTT比色法、克隆形成试验和流式细胞技术检测细胞生长情况。CCNY敲除导致细胞增殖和克隆形成能力显著减少,运用流式细胞术进行分析,在mda-mb-231细胞中,敲除细胞周期蛋白Cyclin Y导致细胞周期阻滞在G0/Gl期,表明Cyclin Y可以直接参与G1/S期的调控。进一步探索细胞周期蛋白Cyclin Y在调控乳腺癌细胞生长过程中潜在的分子机制。对细胞周期蛋白Cyclin Y的敲除,增强了一些蛋白的磷酸化如Bad, p53, GSK3β以及PARP和caspase-3的剪切体。促凋亡蛋白质Bad的磷酸化能够抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡,然而如果Bad蛋白受到抑制则能够增加细胞的生长速率。多功能激酶GSK-3β在丝氨酸Ser9(22、23)的磷酸化却抑制了其活性。GSK-3β蛋白的抑制作用反而促进了结肠癌细胞的凋亡。caspase-3和PARP剪切体含量的增加是指示细胞凋亡的可靠指标。这些表明,细胞周期蛋白Cyclin Y的敲除可能通过激活某些蛋白来诱导细胞凋亡,比如活性蛋白Bad, GSK-3β,PARP,p53依赖的caspase 3,因此,通过RNAi敲除Cyclin Y的表达可能是乳腺癌的分子靶向治疗的一个理想选择。
[Abstract]:With the development of molecular biology , cell biology and life analytical chemistry , the research on functional genomics of " post - genome era " has been deepened , and more and more genes that promote the development of tumor cells have been studied .
The expression of Cyclin D2 , Cyclin E , Cyclin B1 in HO - 8910 and HO - 8910 PM cell line UHRF1 was detected by flow cytometry . The results showed that the expression of HO - 8910 and HO - 8910 PM cell line UHRF1 gene was detected by flow cytometry .
The expression of UHRF1 in ovarian carcinoma was studied by RT - PCR and Western - blot . The expression of UHRF1 mRNA and protein in ovarian cancer tissues was analyzed by RT - PCR and Western - blot .
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本文编号：1744773