TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达

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HEREDITAS (Beijing) 2011年7月, 33(7): 749―756 ISSN 0253-9772

研究报告

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00749

TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达

孔庆然, 朱江, 黄波, 郇延军, 王峰, 石永乾, 刘仲凤, 武美玲, 刘忠华

东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030

摘要: 不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因, 组蛋白修饰作为表观遗传修饰

的一个重要部分, 可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂, 可以改变组蛋白的乙酰化水平, 促进表观遗传重编程, 提高克隆动物的效率。同时TSA能改变染色质结构, 使转录因子易于与DNA序列结合, 促进外源基因的表达。文章确定了TSA处理转基因猪成纤维细胞和核移植胚胎的最佳条件, 分别为250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h, 通过进一步正交实验发现, TSA同时处理供体细胞和克隆胚胎可以显著的促进核移植胚胎的体外发育。此外, 无论TSA处理转基因猪成纤维细胞或核移植胚胎, 都可以提高外源基因的表达水平。

关键词: TSA; 体细胞核移植; 胚胎发育; 外源基因表达; 猪

TSA improve transgenic porcine cloned embryo development and transgene expression

KONG Qing-Ran, ZHU Jiang, HUANG Bo, HUAN Yan-Jun, WANG Feng, SHI Yong-Qian, LIU Zhong-Feng, WU Mei-Ling, LIU Zhong-Hua

College of Life Science, Northeast Agricultural University of China, Harbin 150030, China

Abstract: Uncompleted epigenetic reprogramming is attributed to the low efficiency of producing transgenic cloned animals. Histone modification associated with epigenetics can directly influence the embryo development and transgene expression. Trichostatin A (TSA), as an inhibitor of histone deacetylase, can change the status of histone acetylation, im-prove somatic cell reprogramming, and enhance cloning efficiency. TSA prevents the chromatin structure from being con-densed, so that transcription factor could binds to DNA sequence easily and enhance transgene expression. Our study estab-lished the optimal TSA treatment on porcine donor cells and cloned embryos, 250 nmol/L, 24 h and 40 nmol/L, 24 h, re-spectively. Furthermore, we found that both the cloned embryo and the donor cell treated by TSA resulted in the highest development efficiency. Meanwhile, TSA can improve transgene expression in donor cell and cloned embryo. In summary, TSA can significantly improve porcine reconstructed embryo development and transgene expression.

Keywords: TSA; somatic cell nuclear transfer; embryo development; transgene expression; pig

收稿日期: 2010?10?15; 修回日期: 2010?12?21

基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项(编号：2008ZX08006-002, 2009ZX08006-001B)和东北农业大学“创新团队”发展计划项目资助

作者简介:孔庆然, 博士, 讲师, 研究方向：胚胎工程与转基因动物。Tel: 0451-55191747; E-mail: kqr1982@yahoo.com.cn

朱江, 硕士, 研究方向：胚胎工程。Tel: 0451-55191747; E-mail: zhujiang1021@yahoo.cn

孔庆然和朱江同为第一作者。

通讯作者:刘忠华, 博士, 教授, 研究方向：胚胎工程与转基因动物。E-mail: liu086@yahoo.com

网络出版时间: 2011-5-23 16:48:25

URL:

750 HEREDITAS (Beijing) 2011 第33卷

转基因技术经过近半个世纪的发展, 已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来, 与核移植技术的结合, 转基因效率大大提高, 携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加[1]。近年来, 体细胞克隆猪、转基因细胞克隆猪相继诞生[2~5], 这些突破极大的促进了基础研究的发展, 推动了生物医学和畜牧业生产的进步[6]。

虽然我们已经能够得到体细胞克隆猪, 但是克隆猪的效率依然较低。造成克隆猪效率低下的一个重要原因是不彻底的表观遗传重编程[7]。研究表明, 体细胞不彻底的表观遗传重编程, 会严重影响核移植胚胎的发育[8], 卵母细胞胞质对体细胞核彻底的重编程, 是决定核移植胚胎发育, 产生克隆动物的一个重要条件[9]。组蛋白乙酰化作为表观遗传修饰的一个重要部分, 在核移植胚胎发育过程中起着重要的作用[10]。组蛋白乙酰化可以使染色质的结构松散, 促进转录因子与DNA结合, 进而促进相关发育基因的正常表达。研究表明, H3K9的乙酰化与染色质的活性构象相关[11], H4K16的乙酰化则直接影响染色质高级结构的包装[12]。

曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是一种去乙酰化酶抑制剂, 其通过抑制去乙酰化酶的活性来提高组蛋白的乙酰化程度。TSA处理供体细胞和克隆胚胎, 可以促进胚胎发育相关基因Oct4、Sox2、FGF4、c-Myc、Klf4、Enomes和 Cdx2的表达[13], 从而显著促进小鼠、牛等动物克隆胚胎的发育[14,15]。在猪上, 已有实验表明用TSA处理核移植胚胎可以显著提高其体外发育率

[16]

与克隆猪的

出生率[17]。但是用TSA处理后, 出生克隆猪的死 亡率较高[16], 这使得我们担心TSA对胚胎是否有负面作用。因此我们需要进一步探索TSA处理供体细胞和核移植胚胎的最适浓度和时间, 得到最佳的处理方式。转基因动物中, 普遍存在着外源基因沉默的现象, 外源基因的沉默与表观遗传修饰密切相 关[18], TSA作为组蛋白乙酰化修饰的调节药物, 能否促进转基因细胞或转基因重构胚中外源基因的表 达, 至今尚无相关研究报道。探索TSA对转基因细胞及其核移植胚胎中外源基因表达的影响, 可使我们进一步了解外源基因在转基因动物中的表达情况及其 调节机制, 为转基因动物的培育奠定理论与技术基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

胎儿成纤维细胞取自妊娠32 d长白猪胎儿, eGFP转基因细胞取自体细胞核移植技术产生的eGFP转基因克隆猪; 猪卵巢取自哈尔滨呼兰屠宰场。 1.2 方法

1.2.1 成纤维细胞的分离和培养

在猪场采集妊娠母猪的子宫或成猪耳部组织,

置于37℃添加双抗的生理盐水中, 迅速运回实验室。从猪子宫中取出胎儿, 用PBS清洗干净, 去除四肢、头部, 眼科剪充分剪碎; 耳部组织用PBS清洗干净后直接剪碎。加入3 mL 1 mg/mL胶原酶, 置于37.5℃、5%CO2培养箱中消化2~3 h。消化后2 000 r/min离心10 min, 去上清液, 用4 mL培养液(高糖DMEM+ 10% FBS)重悬, 1 000 r/min离心5 min, 去上清, 再用细胞培养液重悬细胞/细胞团块液, 取2~3 mL移入φ=7 cm培养皿中并加入4 mL培养液, 置于38.5℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁50%~60%时, 半量更换培养液, 以后每2 d全量换液一次, 并观察细胞生长情况; 待细胞长满培养皿底80%~90%时, 吸去培养液, 用DPBS清洗2~3次, 加入0.5 mL 0.25%胰酶消化2~4 min, 用等量细胞培养液终止消化, 轻轻吹打成单细胞悬液, 1 000 r/min离心5 min, 细胞培养液将所得细胞沉淀制成悬液, 以1~2×106个/mL细胞浓度接种在9 cm培养皿中, 置于培养箱中培养, 每2 d全量换液一次。3~5代后可用于后续实验。

1.2.2 核移植胚胎的构建

1.2.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 将屠宰场收集的卵巢置于37℃添加双抗的生理盐水中, 运送回实验室。用注射器抽取卵巢表面直径为3~6 cm的卵泡, 收集含有卵丘卵母细胞复合体的液体, 用TL-HEPES洗2次后, 在显微镜下挑选具有3层以上卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体进行培养。培养液为改进的TCM199加10% 卵泡液, 培养条件为39℃、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱。成熟培养42 h后, 用0.1%的透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体, 去除卵丘细胞, 在显微镜下挑选带有极体的卵母细胞,

第7期

孔庆然等: TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达 751

作为成熟卵母细胞, 用于核移植实验。

1.2.2.2 体细胞核移植 将成熟的卵母细胞置于7.5 mg/mL细胞松弛素B的操作液中, 采用盲吸法, 在显微镜下吸出第一极体及其周围的部分胞质, 以吸出1/4左右的胞质认为完全去核。选取外表光滑、发亮的细胞, 注入透明带和质膜之间, 使供核细胞与质膜紧密接触。

1.2.2.3 融合与激活 采用电击的方法, 一步实现融合与激活。将胚胎置于融合液中, 使两细胞的接触面与两电极的连线垂直, 1.2 kv/cm、30 μs直流电电击2次。在猪胚胎培养液静置30 min后, 选取融合的胚胎, 进行胚胎培养。

1.2.2.4 核移植胚胎的体外培养 融合的胚胎置于PZM-3培养液中培养, 培养条件为39℃、5% CO2、饱和湿度。培养至36 h检测卵裂率, 156 h检测囊胚率及囊胚细胞数。

1.2.3 成纤维细胞与核移植胚胎的药物处理

在细胞培养液中添加相应质量的TSA, 使其到达指定的浓度, 用此培养液培养细胞, 达到处理时间后, 更换正常的培养液进行培养。

在PZM-3中添加相应质量的TSA, 使其到达指定的浓度, 将重构胚置此培养液中, 达到处理时间后, 清洗, 再移入正常的PZM-3中培养。 1.2.4 细胞形态观察与活率分析

收集各不同处理条件下的成纤维细胞, 在光镜下观察细胞形态, 采用Computer-assisted cell analysis system (CASY) I cell-analyzing unit (Sch?rfe Systems, Reutlingen, Germany)细胞分析仪检测细胞活率。 1.2.5 流式细胞仪分析

将GFP转基因猪成纤维细胞用胰酶消化, PBS清洗后悬浮, 进行流式细胞仪检测。细胞检测时, 激发波长设为488 nm, 接受波长设为525 nm, 并通过对野生型猪成纤维细胞(对照)的检测, 确定测量点(排除阴性细胞的自发荧光)、检测门(排除细胞碎片和死细胞)和检测速度(保证细胞的生物活性)。 1.2.6 实时定量PCR分析

提取核移植胚胎的总RNA(RNeasy Mini Kit,

Qiagen), 将提取的RNA反转为cDNA (PrimeScriptTM RT Reagent Kit, TaKaRa), 然后用Real-time PCR检测GFP基因的表达情况(SYBR Premix Ex TaqTM , TaKaRa)。GFP的上游引物为5'-TGAACCGCATCGA GCTGAAGGG-3', 下游引物为5'-ACCTTGATGCC GTTCTTCTGCTTG-3', 18S rRNA作为内参, 其上游引物为5'-TCCAATGGATCCTCGCGGAA-3', 下游引物为5'-GGCTACCACATCCAAGGAAG-3'。 1.2.7 荧光分析

收集不同时期的GFP转基因细胞核移植胚胎, 使用蛋白酶K去掉透明带, 固定、透膜后, 用10 mg/L Hoechst 33342染色, 压片后于荧光镜(Nikon 70i)下观察细胞核及GFP的分布与表达情况。

2 结果与分析

2.1 TSA 处理对猪胎儿成纤维的影响

用0 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的TSA分别处理第3代胎儿成纤维细胞12 h、24 h、48 h、72 h、96 h, 取样检测细胞活率。结果如图1所示。随着TSA处理浓度的增大和处理时间的增长, 细胞活率都会出现显著的下降。0.25 μmol/L TSA处理细胞24 h, 细胞活率不会出现显著下降, 与对照组基本保持一致。

对不同浓度和时间TSA处理的细胞进行形态学观察, 结果如图2所示。0.25 μmol/L TSA处理成纤维细胞24 h后, 细胞形态与正常细胞相同, 没有出现异常形态的细胞, 但是随着处理浓度的增加和处理时间的增长, 细胞会出现变长、膨胀和贴壁力下降等现象。

2.2 TSA 处理对转基因猪成纤维细胞中外源基因

表达的影响

TSA 处理对转基因猪成纤维细胞中外源基因表达的影响如图3所示。与对照组相比, 0.25 μmol/L TSA处理GFP转基因细胞24 h后, GFP表达明显增强, GFP阳性细胞数也显著增加。为了更精确的确定GFP阳性细胞的比例, 用流式细胞仪对处理和未处理组进行了检测, 结果如图4所示, 经TSA处理后, GFP阳性细胞数较未处理组增加近一倍。

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第33卷

图1 TSA对猪成纤维细胞活率的影响

A: 不同处理浓度和处理时间的TSA对猪成纤维细胞活率的影响; B: CASY I细胞活率分析仪检测图例。

图2 TSA对猪成纤维细胞形态的影响(×400)

A: 0 μmol/L (对照)TSA处理对猪成纤维细胞形态的影响; B: 0.25 μmol/L 24h TSA处理对猪成纤维细胞形态的影响; C: 0.5 μmol/L 12h TSA处理对猪成纤维细胞形态的影响; 箭头所指为形态异常的细胞。

2.3 不同浓度TSA处理对克隆胚胎体外发育的影响

采用猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞, 在核移

表1所示。随着处理浓度的升高, 卵裂率并没有显著的变化; 囊胚率则随着处理浓度的升高, 呈现出

, 最适的处理浓度为40 nmol/L, 植胚胎激活后, 分别用0 nmol/L、20 nmol/L、 先升高后降低的趋势

此时的囊胚率显著高于其他处理组和对照组40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L的TSA处理24 h, 检测胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数, 结果如

(P<0.05), 囊胚细胞数也显著高于对照组(P<0.05)。

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