转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究

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好

9期　　　　　　　　　　　　杜建中,等:转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究1721

率高达50%以上,损失极为严重[3].因此有效的病害防治与抗病育种工作就显得日益迫切和重要.

植物基因工程拓宽了植物可利用的基因库,为创造新种质资源、培育植物新物种开辟了新的技术路线[4].目前转基因在200多种植物上获得成功,有3000多例转基因植物进入田间试验[5].2006年全球转基因玉米种植面积达2520万hm2,我国转基因作物的面积也有350万hm2[6].转基因玉米抗性品种的选育和种植取得了巨大的经济效益和社会效益.

几丁质是大多数真菌细胞壁的组分,而植物体内不存在.组分几丁质,,.

自1986年Powell等次将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因转入烟草并获得抗TMV的烟草植株以来,植物抗病基因工程取得了很大进展.1986年Schlumbaum等[7]发现提纯的菜豆几丁质

研究所段运平提供.ELISA分析用的第一抗体是几丁质酶基因表达产物的兔抗血清,第二抗体是碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔血清,均来自山西大学生物技术研究所梁爱华实验室.抗病鉴定所用病菌采自发病的田间植株,由本实验室采集保存.

1.1.2　转化质粒图谱　转化玉米自交系‘海9221’

的质粒pGLⅡ2RC21(图1)由美国堪萨斯州立大学Muthkrishnan教授提供.其携带有几丁质酶基因和

潮霉素抗性基因

,农杆菌菌株为LBA4404.

图1　质粒pGLⅡ2RC21结构图

Fig.1　StructureofplasmidpGLⅡ2RC21

1.2　方　法

1.2.1　转化方法　玉米5月初播种,7月中旬开

花,在开花期首先将待转化处理的植株套袋(雌、雄花).第2天早晨收集0.2g左右新鲜花粉,并与10μg质粒DNA混合于20mL的5%蔗糖溶液中,含花粉蔗糖溶液在与质粒DNA(碱解法制备[14],并用PCRFragmentRecoveryKit纯化质粒DNA)混合

酶具有抗真菌活性.Broglie等[8]用从菜豆中分离到的几丁质酶基因转化烟草,首次获得了抗立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的转基因烟草植株.刘伟华等[9]将菜豆几丁质酶基因导入小麦幼胚愈伤组织,转基因植株感白粉病症状减缓,同时还获得1株赤霉菌接种未扩展的转基因T1植株.张志忠等[10]将番茄几丁质酶基因转入西瓜中,获得了对枯萎病抗性增强的转基因个体.王景雪等[11]、杜春芳等[12]利用花粉介导法将几丁质酶基因导入玉米和油菜,皆获得了转基因植株.

有关几丁质酶转化植物获得抗病植株的研究已有不少报道,但直到目前还未见有关几丁质酶转化玉米植株后对诸如玉米丝黑穗病等真菌病害产生抗性的研究和报道.本研究采用花粉介导法[13]将几丁质酶基因导入玉米自交系‘海9221’.在得到转基因株系的基础上,连续数年通过分子检测、田间抗病鉴定、农艺性状筛选等,获得了目的基因能稳定遗传表达、高抗病和其它农艺性状优良的转基因株系.

前后分别用超声波(超声波细胞粉碎仪,宁波新芝)处理溶液.超声波处理参数为:超声波强度350W,处理10次,每次6s,间隔10s.收集处理后的花粉并授粉于预先用剪刀切剪过的花丝上,成熟期收获T0种子.

1.2.2　抗病株系的筛选及检测过程　(1)潮霉素抗

性筛选　T0代种子用0.1%氯化汞溶液表面消毒13min,无菌水漂洗3～5次,然后播种在含潮霉素(15mg!L-1)的无菌沙土中发芽.隔1天浇1次含

有15mg!L-1潮霉素的水溶液,2周后观察并记录

观察结果.将潮霉素抗性筛选得到的抗性苗(疑似转化苗,T1代)移栽到大田,移栽时用1%丝轴黑粉菌菌土覆盖苗根部,以作抗病鉴定.T1代植株长到5～6叶时取幼嫩叶片提取植物总DNA,以质粒DNA为阳性对照,非转化植株为阴性对照,进行PCR检测和Southernblot分析.根据检测结果,将含有目的基因(有特异扩增带或特异杂交带)植株自

1　材料和方法

1.1　材　料

1.1.1　植物材料及抗体来源　选用配合力高、适宜

交授粉,收获T1代种子.再根据田间抗病鉴定结

果,选择发病率低的T1代种子播种(播种时用1%菌土覆盖种子).依次类推得到T2代和T3代种子.

(2)PCR检测　取大田植株5～6叶期幼嫩叶

推广并被广泛用于玉米杂交种生产但不抗丝黑穗病

的玉米自交系‘海9221’,由山西省农业科学院作物

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