尿源非整合诱导人多能干细胞及与人胚胎干细胞基因表达谱比对分析

发布时间：2018-04-15 06:10

本文选题：尿细胞 + 诱导多能干细胞　；参考：《济南大学》2017年硕士论文

【摘要】：人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)与人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)高度相似:显示ESCs样的细胞形态、表达多能干细胞标志物、拥有相似的基因表达和表观遗传学状态,具有体内外三胚层分化能力。因此,iPSCs为体外研究细胞决定提供了有价值的模型,同时还可分化为病变的细胞从而建立特定的疾病模型用于筛选有效药物、细胞治疗。迄今为止,多种供体来源均可诱导获得人iPSCs,比如皮肤、脂肪组织、外周血等等。然而,这些细胞的获取是有创的。相反,已有研究小组发现不管是健康人或者患者的尿液会是获得iPSCs更好的选择。从尿液中提取细胞相比其他供体细胞具有压倒性的优势,比如安全、成本低、可多次获取、易于被捐赠者接受等。因而,尿源iPSCs(Urinary iPSCs,UiPSCs)可用于建立罕见病疾病模型进而找到疾病有效的治疗方法。目的:本课题旨在建立非整合Ui PSCs技术的实验平台,为后期罕见病模型的建立和发病机制的探究提供一种有效的方法。同时为了进一步研究尿细胞重编程的机制和UiPSCs的生物学特性,因而在基因表达水平比较二者之间的差异,便于更好的利用Ui PSCs来取代ESCs在基础研究、临床实验中的重大位置。方法:(1)收集健康人的尿液样品,分离培养尿细胞,初步分析影响尿细胞成功提取的因素;(2)利用携带OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT的质粒和能提高重编程效率的microRNA 302-367簇诱导尿细胞,采用无血清、无饲养层细胞的培养条件获得UiPSCs;(3)获得i PSCs克隆后,本研究进行了碱性磷酸酶染色、流式细胞术鉴定人ESCs标志物的表达鉴定,完成了初步鉴定;(4)通过基因芯片检测对照组ESCs与实验组UiPSCs基因表达谱的变化,在差异基因的基础上分析GO、Pathway、基因共表达网络等,进一步查阅相关文献,选取与重编程和分化密切相关的目的基因进行q RT-PCR的验证。结果:(1)通过收集大量的尿液样本,我们发现尿细胞的提取过程简单方便,可以作为获取i PSCs的供体细胞,同时夜尿不适宜作为收集尿细胞的来源;(2)采用非整合、无血清、无饲养层细胞、无致癌基因c-MYC的重编程方法获取了Ui PSCs克隆;(3)磷酸酶染色估算重编程效率发现存在个体差异性,同一个人不同批次的尿细胞效率也存在差异;流式细胞法鉴定表达人ESCs核抗原OCT4及表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4,完成了UiPSCs的初步鉴定;(4)基因芯片分析结果显示,对照组ESCs与实验组UiPSCs基因表达谱整体上相近,但还是存在一定差别,我们筛选出19个差异倍数最大的基因。从中选取了4个(TAF9B、NNAT、EGR1、PIWIL2)与维持干性和分化相关的差异基因通过q RT-PCR得到了验证。结合文献报导我们发现,NNAT和EGR1在Ui PSCs中低表达有助于重编程反应的完成,TAF9B是神经分化的重要调控因子在UiPSCs中高表达(差异倍数高于9),可以部分解释Ui PSCs在神经分化方面具有的优势。结论:掌握了获取Ui PSCs的非整合、无血清、无饲养层细胞、无致癌基因c-MYC的重编程方法,得到一株尿源非整合i PS细胞株,为后续疾病模式的建立和研究提供了基础。通过比较ESCs与Ui PSCs基因表达谱的差异,我们发现二者存在显著差异的基因,尤其是与干性的维持相关,并且TAF9B的高表达可能是影响Ui PSCs神经分化偏好性的分子基础。本课题研究的ESCs与UiPSCs的分子学差异将推动Ui PSCs在疾病模型、药物发现、再生医学等领域的应用。
[Abstract]:The aim of this study is to provide an experimental platform for the development of non - integrated Ui PSCs and to establish a specific disease model for the screening of effective drug and cell therapy . The results showed that : ( 1 ) The expression profiles of human ESCs and UiPSCs in the experimental group were identified by the method of non - integration , no serum , no feeder layer cells and no carcinogenic gene . By comparing ESCs and Ui PSCs gene expression profiles , we found that there were significant differences between ESCs and Ui PSCs .

【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

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