盾壳霉产孢相关基因的功能研究

发布时间：2018-04-16 03:35

本文选题：盾壳霉 + 核盘菌　；参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：盾壳霉(Coniothyrium minitans)作为菌核病的重要生防菌,其产孢和寄生能力备受研究者关注。先前实验室为了在分子水平上研究其分生孢子产生及重寄生机制,构建了野生型菌株ZS-1的T-DNA插入突变体库。本文以插入体库中3株产孢异常的转化子ZS-1N22225,ZS-1TN1961和ZS-1TN5012为材料进行研究,实验结果如下:菌株ZS-1N22225的菌落颜色较浅,生长慢,产孢量少,为T-DNA单拷贝插入突变体。通过反向PCR克隆到了Vam6/Vps39的同源基因CmVps39,CmVps39序列全长具有3315 bp,包括一个3216 bp的开放阅读框及两个内含子,推定编码1071 aa的蛋白质。T-DNA插入在该基因的启动子区域,使得ZS-1N22225中该基因的表达量降低。CmVps39蛋白在N端和C端分别含有一个非常保守的CNH和CLN结构域,与其它真菌中Vps39具有高度同源性。通过基因敲除与互补技术研究CmVps39的功能,表明CmVps39敲除转化子ΔCmVps39与T-DNA突变体ZS-1N22225的生物学性状一致,其生长速度、分生孢子的产生量以及寄生核盘菌菌核的能力都明显降低,而互补菌株的生物学性状都得到了恢复,这表明CmVps39在盾壳霉的菌丝生长、分生孢子的产生及重寄生过程中都具有十分重要的作用。进一步的研究发现,CmVps39定位于液泡,ΔCmVps39突变体的液泡不能融合成核心大液泡,而表现为众多小囊泡无规律的分布。同时,发现基因CmVps39不仅能调控液泡的形态,也具有维持渗透和pH平衡的作用。此外,研究发现基因CmVps39还参与到细胞自噬过程,该基因的缺失导致细胞自噬的程度减弱,从而影响了盾壳霉的产孢、孢子萌发和重寄生能力。菌株ZS-1TN1961生长正常,菌落颜色偏白,是T-DNA单拷贝插入的突变体。采用hiTAIL-PCR技术克隆到了T-DNA插入位点的左侧序列,对其进行分析,发现T-DNA破坏了一个可能的基因,该序列具有1327 bp,包括一个1131 bp的开放阅读框以及三个内含子,推定编码一个376 aa的假定蛋白,此假定蛋白包含一个非常保守的Aim24结构域,因此命名此基因为CmAim24。T-DNA插入在基因CmAim24的编码区域,距离起始密码子(ATG)46 nt。进一步通过基因敲除和互补技术对该基因的功能进行研究,发现该基因在盾壳霉分生孢子的产生和萌发以及寄生核盘菌菌核方面起着重要作用。此外,通过亚细胞定位发现该基因定位于线粒体,敲除该基因导致线粒体畸形、肿大、结构松散。同时,细胞内活性氧含量上升,ΔCmAim24在非发酵性碳源上的生长受到更大程度的抑制。菌株ZS-1TN5012是一株菌落颜色较浅、生长慢、分生孢子产生有缺陷的突变体。Southern blot证明ZS-1TN5012为T-DNA单拷贝插入突变体,通过hiTAIL-PCR技术克隆了突变菌株ZS-1TN5012中T-DNA所在位点左侧的核苷酸序列。序列分析表明T-DNA插入破坏了一个全长为1170 bp的基因,该基因不包含内含子,推定编码389 aa的蛋白质。将推定氨基酸序列进行同源性比较,发现该序列与其它物种的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)具有高度同源性,因此将该基因命名为CmHmgr。HMGR为甲羟戊酸生成通路的限速酶,他汀类药物可以抑制其活性发挥。通过培养基中添加阿托伐他汀发现,ZS-1也表现出突变体ZS-1TN5012一致的表型。此外,突变体ZS-1TN5012对该药物的敏感性增加。通过亚细胞定位发现,该基因定位在盾壳霉的线粒体,进一步通过基因敲除和互补技术表明,该基因影响盾壳霉孢子的形成及重寄生作用。综上,本研究从盾壳霉中克隆到三个产孢相关基因CmVps39、CmAim24和CmHmgr。研究发现,这三个基因都影响了盾壳霉分生孢子的产生和重寄生能力,说明盾壳霉分子孢子形成和寄生过程十分复杂,受到多种基因的调控。
[Abstract]:The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . This gene was identified as CmHmgr.HMGR is a restriction enzyme which has a full length of 1170 bp . The gene does not contain intron , and it is a putative protein encoding 389 aa . The gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the addition of atorvastatin , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the subcell localization , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.After the gene knockout and complementary techniques , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.These three genes are very complex to the formation and parasitism of the conidium of the pelarmold .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476

【参考文献】