影响猪胚胎附植及胎盘褶皱发育相关基因的鉴定

发布时间：2018-04-19 09:46

  本文选题：大白猪 + 梅山猪　； 参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：提高母猪产仔率以及断奶前仔猪的成活率对提高养猪企业的经济效益有重要影响。在附植期,胚胎死亡率可达25%左右,是影响产仔数的重要因素。胎盘形成后,胎盘效率直接影响着胎儿的发育。国内梅山猪拥有高繁殖率的原因之一被认为是其具有较高的胎盘效率。母胎界面胎盘褶皱的形成与发育是影响猪胎盘效率的重要因素。因此分析鉴定影响胚胎附植以及影响胎盘褶皱形成与发育的相关基因对提高母猪产仔率和断奶前仔猪成活率具有重要意义,能为高繁殖力母猪的培育提供有价值的育种素材。本研究以纯种大白猪和梅山猪的初产母猪为研究对象,选取母猪妊娠12、15、18、26、50、95天子宫和胎盘为实验材料,通过表型组学分析不同妊娠阶段及不同品种间子宫和胎盘的形态功能变化,通过检测相关因子的定位定量表达来分析鉴定影响胚胎附植与胎盘褶皱发育的相关基因,得到以下结果:1.影响猪胚胎附植相关基因的鉴定猪附植时胚胎不侵入子宫内膜中,而是胚胎滋养层上皮与子宫内膜腔上皮相互粘附,因此粘附分子对胚胎成功附植至关重要。免疫组化实验证实粘附分子CD34在附植期间母胎界面上皮细胞中表达,且其蛋白的阳性信号主要位于细胞膜上。在大白猪妊娠15天,CD34蛋白主要在胚胎滋养层上皮细胞中表达,而在子宫内膜腔上皮细胞中几乎不表达。在妊娠26天,CD34蛋白在整个母胎界面上皮双分子层中表达。说明CD34蛋白可能参与胚胎与子宫内膜的粘附。另外,附植期胚胎需要分泌大量的雌激素作为母体妊娠识别信号,需要从母体转运大量的雌激素合成前体物质-胆固醇,因此胆固醇转运载体对胚胎附植具有重要作用。结果显示ABCA1在大白猪和梅山猪妊娠12、15、和18天中表达于子宫内膜腔上皮细胞,但几乎不表达于子宫腺体和胚胎滋养层上皮细胞中。ABCA1蛋白在猪子宫系膜侧(胚胎附植侧)的表达量强于系膜对侧。SR-BI蛋白在大白猪和梅山猪子宫内膜腔上皮细胞、腺体上皮细胞以及滋养层细胞中都表达,且其在子宫系膜侧和系膜对侧的表达量没有显著不同。胆固醇合成通路限速酶HMGCR mRNA在妊娠12和15天胚胎中的表达很弱,说明胚胎自身合成胆固醇的能力很弱。这些结果说明了胆固醇从母体向胚胎转运的路径,并且表明ABCA1还对胚胎向系膜侧定向附植可能发挥重要作用。2.猪胎盘褶皱发育的机制探究胎盘褶皱的形成迅速增大了母胎界面营养物质的交换面积,极大地提高了母胎营养物质交换效率,即胎盘效率。我们系统检测了具有胎盘效率差异的不同品种母猪妊娠过程中母胎界面的表型组,并且初步研究了调控胎盘褶皱发育的分子机制。2.1与大白猪相比,梅山猪妊娠后期胎盘滋养层上皮细胞增殖能力更强,褶皱复杂度更高形态学测量发现,随着妊娠的进行,每单位面积胎盘褶皱的长度(褶皱复杂度)显著增加。在妊娠95天,梅山猪胎盘褶皱复杂度显著大于大白猪褶皱复杂度。滋养层上皮细胞在褶皱发育过程中分化成柱状上皮和立方状上皮。大白猪和梅山猪滋养层上皮细胞在妊娠26天时都为柱状,但在妊娠50天时分化为高柱状(褶皱顶端)和立方状(褶皱底端和侧面)。在妊娠95天时梅山猪所有滋养层上皮细胞都变成立方状而大白猪褶皱顶端滋养层上皮细胞仍为高柱状。细胞增殖标记分子Ki67结果显示褶皱顶端的高柱状滋养层上皮细胞增殖能力弱,而褶皱底端细胞增殖能力强。用来指示细胞分泌糖原、糖蛋白等大分子物质的PAS染色的阳性信号主要在高柱状滋养层上皮细胞中分布。以上结果揭示了梅山猪比大白猪具有更高胎盘效率的另一机制。梅山猪妊娠后期胎盘褶皱复杂度更高,物质交换面积得到补偿。其次,研究结果表明增殖能力强的立方状滋养层上皮细胞可能具有促进胎盘褶皱发育的功能。2.2 ZEB2介导的信号通路通过调控滋养层上皮分化而促进褶皱的发生和发育E-cadherin表达高的上皮细胞细胞间粘附紧密,迁移能力弱,分泌能力强。结果表明,E-cadherin在褶皱顶端的高柱状滋养层上皮细胞中高表达,在褶皱底端和侧面的滋养层上皮细胞中几乎不表达,且阳性信号分布于细胞膜。妊娠95天,大白猪褶皱顶端滋养层上皮细胞仍表达E-cadherin,而梅山猪所有滋养层上皮细胞都几乎不表达E-cadherin。β-catenin分子与E-cadherin的表达模式一致。ZEB1和ZEB2转录因子可以通过抑制E-cadherin在上皮细胞中的表达来调控上皮细胞的分化。结果显示ZEB2表达模式与E-cadherin恰好相反,且阳性信号位于细胞核中。而ZEB1在滋养层上皮细胞中不表达。说明在猪滋养层上皮细胞中调控E-cadherin表达的是ZEB2而非ZEB1。表达ZEB2但不表达E-cadherin的立方状滋养层上皮细胞能表达上皮细胞标记分子Cytokeratin,且不表达间质细胞标记分子Vimentin。说明立方状滋养层上皮细胞仍维持上皮细胞特性,从而维持胎盘屏障的存在。2.3基质重塑相关基因对褶皱发育的影响黏着斑相关蛋白FAK、Paxillin以及integrin-αv在胎盘滋养层上皮细胞中都几乎不表达,但是FAK蛋白在妊娠26天靠近胎盘褶皱的子宫内膜基质细胞中高表达,说明此区域的胞外基质硬度高(stiffer)。由于大部分细胞都具有“趋硬性”(Durotaxis)即细胞偏向细胞外基质硬度高的一侧迁移。胎盘滋养层上皮细胞可能会偏向于向这部分胞外基质硬度高的区域迁移,从而促进褶皱的形成。另外,HAI-1在上皮细胞中能通过调控细胞外基质降解酶的活性来调控组织重塑,细胞的分化与迁移等生物学过程。免疫组化结果显示HAI-1蛋白表达模式与E-cadherin类似。在胎盘高柱状滋养层上皮细胞中高表达,而在立方状滋养层上皮细胞中低表达或不表达。荧光定量PCR的结果显示妊娠50天胎盘组织中的表达量最高。另外发现了猪HAI-1基因3’UTR区的一个SNP位点,利用Alu1-PCR-RFLP方法对HAI-1基因中的T/C多胎位点进行分析发现,其与母猪的窝平均初生重及仔猪初生重有显著关联。
[Abstract]:The results of this study were as follows : 1 . The results showed that the expression of CD34 protein in the human fetal interface epithelial cells was significant . The results showed that the expression of CD34 protein in the epithelial cells of the pregnant sows was higher than that of the endometrium . The results showed that the expression of ABCA1 in the fetal connective tissue was stronger than that of the mesentery . The expression of ABCA1 protein in the fetal uterine membrane side ( embryo attachment side ) was stronger than that of the mesentery .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

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