池州市鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及gD基因序列分析

发布时间：2018-04-19 15:52

  本文选题：鸡传染性喉气管炎病毒 + 池州分离株　； 参考：《安徽农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡病毒性呼吸道疾病,可引起鸡死亡或产蛋下降而造成严重的经济损失。2015年安徽省池州某鸡场120日龄蛋鸡发生疑似鸡传染性喉气管炎,该场存栏5000只,临床症状为呼吸困难,发病率为60%,死亡率为60%,为了对该场发病情况进行确诊,本研究采集病鸡喉头气管组织及其分泌物,剪碎加入3倍体积无菌0.2MPBS充分研磨,反复冻融三次后离心取上清加入青-链霉素(500U/mL)4℃孵育过夜,置于-80℃冰箱备用。提取病鸡喉头气管及其分泌物总DNA并根据GenBank发表的鸡传染性喉气管炎病毒gD基因设计合成一对特异性引物,从发病鸡喉头及其分泌物中扩增出1134bp大小片段,.制备的组织液上清经鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)途径接种10日龄SPF鸡胚,120h后打开鸡胚,发现在鸡胚CAM上发现典型痘斑,收集病变鸡胚痘斑和尿囊液,充分研磨,反复冻融并离心取上清按照相同途径连续接种鸡胚三次,取第4代鸡胚分离毒作为种毒,保存于-80℃;将种毒通过滴鼻、点眼的方式接种5日龄健康麻羽肉鸡,每只102EID50作为试验组,并使用同等剂量的无菌PBS设置阴性对照,连续观察,结果发现:攻毒3d后试验组出现采食量下降,呼吸困难,眼结膜坏死等症状,第4～5d症状加重并出现两只雏鸡死亡,第9d开始预后;而同时对照组无任何症状;剖检病死鸡发现其喉头气管出血,盲肠扁桃体肿大,并可从病死鸡喉头气管及其分泌物中检测到病毒。结果证实分离到一株鸡传染性喉气管炎病毒,命名为CZ-ILTV16株。以第4代鸡胚分离毒为材料提取病毒DNA,并扩增gD基因,胶回收纯化后克隆至pMD18-T载体,转化入DH5α感受态细胞,挑取单克隆鉴定正确后进行测序,结果发现与GenBank上已发表gD基因序列同源性在99%以上,基因进化树分析结果发现,分离毒处于独立分支,且与Serva株的亲缘性较近;
[Abstract]:Infectious laryngotrachetitis (ILT) is a viral respiratory disease caused by infectious laryngotracheitis virus (ILTV).In 2015, a 120-day-old laying hens in Chizhou, Anhui Province, was suspected to have infectious laryngotracheitis. 5000 chickens were stored in the farm, with clinical symptoms of dyspnea.The incidence rate was 60 and the mortality rate was 60. In order to confirm the incidence of the disease, the trachea tissue and its secretion were collected, and three times the volume of aseptic 0.2MPBS were shredded.After repeated freezing and thawing for three times, the supernatant was centrifuged and incubated overnight at 4 鈩，

本文编号：1773735