嗜酸乳杆菌中c-di-GMP相关基因的功能分析及其下游信号通路的研究

发布时间：2018-04-26 21:04

本文选题：c-di-GMP + 嗜酸乳杆菌　；参考：《南方医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的c-di-GMP(环二鸟苷酸)是一种由两分子GTP缩合形成的环二核苷酸,为细菌中广泛存在的第二信使,参与调控多项细菌生理功能。含GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)调控着菌内c-di-GMP的平衡。嗜酸乳杆菌属于革兰氏阳性菌,能发酵多种糖,产酸能力强,可使菌斑pH下降,同时具有很高的耐酸力,是公认的龋病相关主要细菌之一。我们前期通过生物信息学分析发现:在嗜酸乳杆菌的基因组中存在一个c-di-GMP合成酶(DgcA)的编码基因(NH13_07045)和两个分解酶(PdeA和PdeB)的编码基因(NH13_07050和NH13_07055)。本研究首次在嗜酸乳杆菌ATCC4356中研究c-di-GMP信号通路,探索c-di-GMP调控嗜酸乳杆菌生理活动的信号机制,为龋病的防治提供新的依据。方法首先采用生物信息学方法分析嗜酸乳杆菌中三个涉及c-di-GMP上游代谢通路的基因以及编码蛋白。使用质粒pMAL-c2-His对NH13_07045-GGDEF结构域编码基因片段,NH13_07050和NH13_07055基因全长进行克隆、表达及纯化,获得目的融合蛋白后,分别进行体外酶活性实验,使用高效液相色谱分析反应产物。使用阿拉伯糖诱导表达质粒pBAD-Myc-His对NH13_07045基因全长进行克隆,在大肠杆菌MG1655和BL21中表达,分别进行动力学实验和刚果红结合实验观察大肠杆菌的表型变化来鉴定DgcA是否具有DGC活性。对PdeB-EAL结构域进行表达纯化,获得目的融合蛋白后,与Fluo-c-di-GMP和Biotin-c-di-GMP 分别进行 DRaCALA(Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay)和紫外交联实验。使用Biotin-c-di-GMP偶联磁珠在嗜酸乳杆菌总蛋白中进行亲和拉下实验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染观察,并切取条带进行液相色谱-串联质谱多肽测序。提取嗜酸乳杆菌ATCC4356的总RNA,逆转录成cDNA,作为模板进行PCR反应,对NH13_07045-NH13_07065的基因进行操纵子序列分析。克隆NH13_07060基因,在大肠杆菌中过表达,进行刚果红结合实验和生物膜形成实验分析其编码的糖基转移酶功能。结果对c-di-GMP代谢相关基因以及编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步基因克隆、表达纯化,酶活性分析提供理论依据。成功构建表达载体pMAL-7045-GGDEF(GGDEFDgcA)、pMAL-7050(PdeA)和 pMAL-7055(PdeB),通过诱导表达,并纯化后,获得目的融合蛋白。体外酶活性实验证明含EAL结构域的胞质蛋白PdeA具有PDE活性,能特异性水解c-di-GMP。成功构建pBAD-7045(DgcA)表达载体,在诱导条件下,大肠杆菌MG1655和BL21呈现胞内高浓度c-di-GMP的表型,证明DgcA蛋白具有DGC活性,能合成c-di-GMP。成功构建表达载体pMAL-7055-EAL(EALpdeB),通过诱导表达并纯化后,获得目的融合蛋白,DRaCALA和紫外交联实验结果显示PdeB的EAL结构域与c-di-GMP能特异性结合。通过液相色谱-质谱的多肽测序,在嗜酸乳杆菌总蛋白中筛选出27个可能与c-di-GMP直接或间接结合的蛋白。对cDNA的PCR分析结果显示,NH13_07045(编码c-di-GMP合成酶DgcA)和NH13_07050(编码 c-di-GMP 降解酶 PdeA)属于同一操纵子,NH13_07055(编码c-di-GMP特异性受体CrpA(PdeB))、编码基因NH13_07060(编码糖基转移酶)和NH13_07065(编码假定蛋白)属于同一操纵子。成功构建pBAD-7060质粒,在大肠杆菌BL21和MG1655中过表达,其表多糖和生物膜形成量增多。结论首次在嗜酸乳杆菌中证明存在c-di-GMP信号通路,DgcA与PdeA具有合成和降解c-di-GMP的酶活性。含退化EAL结构域的CrpA(PdeB)为c-di-GMP下游受体蛋白,同时筛选出嗜酸乳杆菌中27个c-di-GMP的潜在受体蛋白。证明了 DgcA和PdeA由同一操纵子所编码,调控菌体内c-di-GMP的浓度,而c-di-GMP受体CrpA与未知功能的糖基转移酶和假定跨膜蛋白由另一个操纵子编码。证实了 NH13_07060编码的糖基转移酶与细菌表多糖和生物膜的形成有关。这提示c-di-GMP在嗜酸乳杆菌中可能参与调控表多糖和生物膜形成,从而影响嗜酸乳杆菌的致龋特性。以上结果为进一步明确c-di-GMP在嗜酸乳杆菌中的调控机制奠定基础。
[Abstract]:In this study , we studied the expression and purification of c - di - GMP in Escherichia coli MG1655 and BL21 . The expression vector pMAL - 7055 - EAL ( EALpdeB ) was successfully constructed .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.1

【参考文献】