Pim-1基因重组腺相关病毒2载体的构建及感染大鼠视网膜

发布时间：2018-04-28 20:25

  本文选题：Pim- + 腺相关病毒载体　； 参考：《解剖学报》2017年02期

【摘要】：目的构建携带大鼠原癌基因Pim-1的重组腺相关病毒2载体(rAAV2-Pim-1),检测其体内感染大鼠视网膜的细胞类型及目的基因Pim-1在视网膜中的表达。方法 p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物用Nhel酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA并连接转化,鉴定质粒阳性克隆及测序。rAAV2-Pim-1表达质粒p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG及包装质粒p AAV-RC和辅助质粒p Helper,通过Lipofectamine 2000共转染293细胞,纯化获得高滴度的rAAV2-Pim-1。大鼠玻璃体注射rAAV2-Pim-1,用免疫荧光组织化学检测其感染视网膜的细胞类型;用Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在视网膜中的表达。结果rAAV2-Pim-1质粒构建成功并且核苷酸序列比对正确;质粒转染293细胞后出现绿色荧光;包装出的病毒浓缩滴度为5.7×1015vg/L。rAAV2-Pim-1组体内感染视网膜神经节细胞(RGCs)达71%,并感染少量无长突细胞,几乎不感染星形胶质细胞;Pim-1 mRNA和蛋白在视网膜中的表达约为rAAV2-EGFP组的6.61倍和2.29倍。结论成功构建rAAV2-Pim-1病毒载体,并在感染后的大鼠视网膜RGCs中过表达Pim-1。
[Abstract]:Objective to construct a recombinant adeno-associated virus (rAAV2-Pim-1) vector carrying rat proto-oncogene Pim-1, and to detect the cell types of rat retina infected with rAAV2-Pim-1 and the expression of target gene Pim-1 in the retina. Methods p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG vector and PCR product of Pim-1 gene were digested by Nhel and identified by agarose gel electrophoresis. The vector and the target gene DNA were recovered and transformed. The positive clones were identified and sequenced. The pAAV2-Pim-1 expression plasmid p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG, the packaging plasmid p AAV-RC and the auxiliary plasmid p Helper were cotransfected into 293 cells by Lipofectamine 2000, and the high titer of rAAV2-Pim-1 was obtained. After vitreous injection of rAAV2-Pim-1, the cell types of the infected retina were detected by immunofluorescence histochemistry, and the expression of Pim-1 in the retina was detected by Real-time PCR and Western blotting. Results the rAAV2-Pim-1 plasmid was successfully constructed and the nucleotide sequence alignment was correct, the green fluorescence appeared after transfection of the plasmid, the virus concentration titer was 5.7 脳 1015vg/L.rAAV2-Pim-1, and the virus concentration titer was 5.7 脳 1015vg/L.rAAV2-Pim-1 in vivo infected with retinal ganglion cells (RGCs) up to 71%, and infected with a small number of Amphoid cells. The expression of Pim-1 mRNA and protein in the retina was about 6.61 times and 2.29 times of that in the rAAV2-EGFP group. Conclusion the rAAV2-Pim-1 virus vector was successfully constructed, and Pim-1 was overexpressed in the RGCs of the infected rat retina.
【作者单位】： 第二军医大学基础部人体解剖学教研室;
【基金】：国家自然科学基金(31271282;31571239)
【分类号】：R3416

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本文编号：1816737