苦荞黄酮醇代谢转录因子FtMYB7和FtMYB9基因克隆及功能分析

发布时间：2018-05-09 15:34

  本文选题：苦荞 + R2R3-MYB　； 参考：《山西农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：苦荞是一种药食兼用的小杂粮作物,富含高活性的黄酮醇化合物芦丁。目前调控拟南芥黄酮醇代谢途径的MYB转录因子已明确为S7亚家族,本研究从九江苦荞cDNA中克隆得到FtMYB7和FtMYB9两个基因,构建pBI121-35S:FtMYB7和pBI121-35S:FtMYB9过表达载体以及遗传转化烟草,对T0代转基因烟草株系和九江苦荞全生育期中黄酮醇代谢途径关键酶基因进行荧光定量表达分析,以及烟草叶片瞬时表达和原位黄酮染色技术,鉴定发现FtMYB7和FtMYB9基因主要参与调控黄酮醇代谢途径中关键酶的表达,这为进一步探究苦荞富含高活性芦丁化合物的调控机理提供了理论基础。本文主要研究结果如下：(1)已克隆鉴定的FtMYB7基因:GenBank登录号KM588379,全长cDNA序列876bp,编码291个氨基酸;FtMYB9基因：GenBank登录号KM588380,全长cDNA序列912bp,编码303个氨基酸;它们均含有典型的R2R3型MYB结构域。通过构建系统进化树初步确定：FtMYB7与拟南芥S1亚家族聚为一类,NCBI-Blast蛋白序列比对结果表明与丹参中SmMYB61(AGN52085)、SmMYB729(AGN52053)同源性最高,分别为为62%和61%;FtMYB9与拟南芥S7亚家族聚为一类,NCBI-Blast蛋白序列比对结果表明与葡萄中VvMYBPA1(NP_001268160)同源性最高为60%,与可可中TcMYBPA(ADD51352)同源性为58%。(2)‘九江苦荞’全生育期各组织实时定量表达分析结果表明：FtMYB7基因在盛花期的花序中表达最高,FtUFGT1基因在全生育期的表达趋势与FtMYB7基因的调控呈正相关;FtMYB9基因在萌发期的子叶中表达最高,FtFLS-like基因在全生育期的表达趋势与FtMYB9基因的调控有关。(3)对转FtMYB7、FtMYB9和FtMYB7+9基因株系的NtCHS、NtF3H和NtFLS基因进行荧光定量表达分析,结果表明：FtMYB7和FtMYB9基因对NtCHS基因的表达起负调控作用,FtMYB9基因对NtF3H、NtFLS基因的表达起正调控作用。(4)通过对野生型烟草叶片微针注射农杆菌进行瞬时表达、原位黄酮染色,结果表明分别注射35S:FtMYB7和35S:FtMYB9以及共同注射35S:FtMYB7+9后,烟草叶片均产生明显荧光现象,表明有大量黄酮醇化合物合成。
[Abstract]:Tartary buckwheat (Tartary buckwheat) is a small grain crop with high activity, which is rich in flavonol and rutin. The MYB transcription factor which regulates flavonol metabolism in Arabidopsis thaliana has been identified as S7 subfamily. In this study, two genes, FtMYB7 and FtMYB9, were cloned from cDNA of Tartary Buckwheat to construct pBI121-35S:FtMYB7 and pBI121-35S:FtMYB9 overexpression vector and genetic transformation of tobacco. The key enzyme genes of flavonol metabolism pathway in transgenic tobacco lines of T 0 generation and in whole growth stage of Tartary buckwheat were analyzed by fluorescence quantitative expression, transient expression and in situ flavone staining in tobacco leaves. It was found that FtMYB7 and FtMYB9 genes were mainly involved in regulating the expression of key enzymes in flavonol metabolism pathway, which provided a theoretical basis for further exploring the regulatory mechanism of high-activity rutin compounds in Tartary buckwheat. The main results are as follows: 1) the FtMYB7 gene KM588379 has been cloned and identified, and the full-length cDNA sequence is 876 BP, encoding 291 amino acids, FtMYB9 gene accession number KM588380, full-length cDNA sequence 912bpand encoding 303 amino acids, all of which contain typical R2R3 MYB domain. By constructing phylogenetic tree, it was preliminarily confirmed that the sequence alignment of the S1-subfamily of FtMYB7 and Arabidopsis thaliana as a class of NCBI-Blast protein showed the highest homology with SmMYB61AGN52085Sm MYB729AGN52053 in Salvia miltiorrhiza. FtMYB9 and S7 subfamily of Arabidopsis thaliana showed the highest homology with VvMYBPA1 NP00001268160) and the highest homology with TcMYBPAADD51352 in cocoa. The results showed that the expression of FtMYB7 gene was the highest in the inflorescence of flowering stage, and the expression trend of FtUFGT1 gene in the whole growth stage was positively correlated with the regulation of FtMYB7 gene. FtMYB9 gene expressed the highest FtFLS-like gene in the cotyledon of germinating stage. The trend of expression was related to the regulation of FtMYB9 gene.) the fluorescent quantitative expression analysis of NtCHSN NtF3H and NtFLS genes in FtMYB7FtMYB9 and FtMYB7 9 lines was carried out. The results showed that FtMYB7 and FtMYB9 genes play a negative role in regulating the expression of NtCHS gene. FtMYB9 gene plays a positive role in regulating the expression of NtF3HntFLS gene. The results showed that after 35S:FtMYB7 and 35S:FtMYB9 were injected and 35S:FtMYB7 9 was injected together, there were obvious fluorescence phenomena in tobacco leaves, indicating that a large number of flavonol compounds were synthesized.
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S517

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