运用CRISPR-dCas9技术在原代培养T细胞中诱导Foxp3基因过表达和调节性T细胞分化

发布时间：2018-05-09 22:14

本文选题：CRISPR/dCas9 + 过表达　；参考：《西南大学》2017年硕士论文

【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)的特点是免疫细胞对健康细胞和正常组织产生异常的免疫产生排斥反应,而调节性T细胞(CD4+CD25+T细胞)作为成熟T细胞的一个亚类群,在维持机体免疫稳态和预防自身免疫性疾病过程中发挥着重要作用。除此之外,大量研究表明,调节性T细胞功能异常可能是人类自身免疫性疾病发生根本原因之一。如系统性红斑狼疮(SLE)、伴X染色体的性联免疫缺陷综合症(IPEX syndrome)、类风湿性关节炎(RA),以及许多其它自身免疫性疾病都与调节性T细胞的功能失常相关。Foxp3,作为叉头状转录因子家族中的一员,被认为是调节性T细胞的分子标志性基因。已有研究表明,Foxp3基因在胸腺和外周调节性T细胞中都呈现高水平表达,该基因敲除会导致调节性T细胞发育障碍,最终导致严重的自身免疫性疾病。由此可见,Foxp3基因在调节性T细胞的发育和功能维持上是必需的。去活化的Cas9系统(dCas9)是通过诱导Cas9核酸酶的RuvC和HNH两个结构域的核苷酸序列发生突变,进而使其失去活性实现的,dCas9虽然具有结合DNA的能力,但不能编辑DNA。dCas9系统分别融合一个激活元件或抑制元件,可以实现sgRNA介导的靶基因的激活或者抑制,进而产生两种截然不同的功能。CRISPR-Cas9-Pumilioio系统(简称Casilio系统),通过组合CRISPR-dCas9、Pumilio RNA结合蛋白-效应因子和携带一个或多个PUF结合位点的sgRNA(sgRNA-PBS),进而可实现转录调控因子,表观遗传修饰蛋白及荧光蛋白在基因组靶位点上的多聚化。而传统型CRISPR-dCas9系统相对简单,仅通过构建cas9和效应因子的融合蛋白实现的。本研究在不同细胞系中,创新性地使用CRISPR-Cas9-Pumilio系统(Casilio系统)和传统的过表达方法,从外源和内源激活两个方面,系统地比较研究了Foxp3基因激活的效率,最终揭示人外周血原代培养T细胞中Foxp3基因激活诱导调节性T细胞分化的可行性。本论文的研究结果归纳如下:1)首先,在HEK293T细胞系(人肾上皮细胞系)中通过脂质体转染法进行Oct4基因激活实验,验证了传统CRISPR-dCas9和Casilio基因编辑系统的可行性和稳定性,并对系统进行了优化改进。Real-time PCR检测结果发现,Casilio基因编辑系统对Oct4基因的激活效率明显高于传统CRISPR-dCas9系统。而有趣的是,二者高效作用元件混合系统的激活效应要比Casilio基因编辑系统更加优越。总之,混合系统的激活效率Casilio基因编辑系统CRISPR-dCas9基因编辑系统。该结果为后续实验的开展奠定了基础,并为其提供了良好的技术支持。2)用上述基因激活系统在HEK293T细胞系尝试Foxp3基因的激活实验,并通过Real-time PCR检测Foxp3基因表达水平变化。Foxp3基因激活的效果与Oct4基因的激活趋势一致,即混合系统的激活效率Casilio基因编辑系统CRISPR-dCas9基因编辑系统,这说明在HEK293T细胞系中,这些系统对基因的激活效率是稳定的。该研究为Foxp3基因在其它细胞系的激活筛选到了特异性强,激活效率高的候选sgRNA系统。3)Jurkat细胞系(人外周血白血病T细胞)属于CD4 T细胞,可以稳定地进行体外培养和传代,研究中一般作为T细胞模型。根据HEK293T细胞的研究结果,将已构建的Foxp3基因的过表达系统(sgRNA),通过病毒包装感染Jurkat细胞系检测在HEK293T细胞系中稳定工作的三个系统在T细胞系对Foxp3基因的激活效率和稳定性。通过Real-time PCR和流式细胞术检测发现十分显著的激活效果,实验组的Foxp3基因表达水平显著提高。4)通过与医院建立合作,获得少量人外周血并分离得到单核细胞(PBMC),进一步分离得到了原代T细胞进行体外培养。同样用Foxp3基因的过表达系统,感染原代培养的T细胞,研究Foxp3基因的表达水平变化和原代培养的T细胞分化方向和命运改变。结果显示,混合系统能够显著提高Foxp3基因的表达。增殖抑制实验表明,所得细胞群能够抑制CD4+CD25-细胞的增殖,这说明所得细胞具有调节性T细胞功能特征之一(增殖抑制)。综上所述,我们通过大量的实验检测了CRISPR/Cas9基因激活和EF1α介导在不同细胞系对Foxp3基因的激活效率和稳定性。研究发现,通过激活效果最优的基因激活系统和过表达的方法,在人的原代培养T细胞中获得了高水平表达Foxp3基因和具有增殖抑制功能的调节性T细胞。本研究为进一步高效诱导调节性T细胞分化体系的优化奠定了坚实的基础,今后我们实验的工作重点是探索在原代培养T细胞中,尝试几种基因激活系统的不同组合,不断优化各项指标,以期获得诱导调节性T细胞分化的最优化条件。进而为以后自身免疫疾病的治疗研究奠定基础,为减轻自身免疫疾病患者的痛苦做出贡献。
[Abstract]:This study shows that Foxp3 gene plays an important role in the development and function of regulatory T cells . In this study , the expression level of Foxp3 gene and the expression level of Foxp3 gene were determined by real - time PCR and flow cytometry .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.2

【参考文献】