甘蓝型油菜苗期耐盐相关基因QTL定位及候选基因分析

发布时间：2018-05-19 07:58

  本文选题：甘蓝型油菜 + 耐盐性　； 参考：《西北农林科技大学》2017年硕士论文

【摘要】：土壤盐碱化是危害农作物产量和品质的非生物胁迫之一,油菜耐盐品种的选育、推广与应用将提高对盐碱地的利用。本实验室对甘蓝型油菜耐盐进行了多年的研究,筛选出了一批耐盐的甘蓝型油菜材料,为了研究甘蓝型油菜耐盐性的遗传机理,本课题在前期的研究中选取了耐盐品系2205(甘蓝型油菜育种骨干亲本Xu821)与敏盐品系1423(Xu867),构建了一个含94个株系的F2:3群体,利用分子标记技术建立了一张含有173个SSR位点以及30个AFLP位点,覆盖甘蓝型油菜19个连锁群的遗传连锁图谱,图谱总长792.064cM,标记间的平均距离为3.9cM(丁娟2015)。由于该图谱标记数少,图距大,对候选基因的筛选有一定困难。因此,本研究在此基础上对该遗传连锁图谱进行加密,通过耐盐相关生理指标的测定进行QTL定位和耐盐相关基因的克隆、表达等研究,为甘蓝型油菜耐盐机理以及耐盐分子育种奠定基础。本研究取得主要结果如下:1.盐胁迫下亲本和F2:3家系耐盐性与生理及形态指标的相关分析采用200 mmol·L-1 NaCl溶液,利用水培法对双亲及F2:3群体在苗期进行盐处理,测量处理后叶绿素等10个耐盐相关指标。结果表明,耐盐亲本2205的10个指标中,叶绿素(SPAD)、超氧化物歧化物(SOD)、可溶性蛋白(SP)、叶干重(LDW)、根干重(RDW)、叶鲜重(LFW)、根长(RL)和苗高(SH)在200mmol·L-1NaCl胁迫下,均明显高于敏盐亲本1423,而电导率(EC)和耐盐等级(STR)比1423值低于1423。分别对10个指标进行正态分布检验,偏度和峰度的绝对值小于1,均符合QTL作图的要求。F2:3各指标之间存在相关性。其中,STR与EC成极显著正相关,相关系数为0.212,与SPAD、RDW负相关,相关系数都为-0.213。SPAD和EC成极显著负相关,相关系数为-0.329,与SP成正相关,系数为0.219。EC与RL、LFW、LDW和RDW成负相关,相关系数分别为-0.279、-0.309、-0.279和-0.215。RL与LFW和LDW成正相关,相关系数分别为0.598和0.674。SH与LDW成正相关,相关系数为0.302。SOD与RDW成负相关,相关系数为-0.231。LDW与LFW、RDW成正相关性,相关系数分别为0.815和0.213。2.甘蓝型油菜全基因组遗传连锁图谱的加密共选取了1800对SSR引物、64对AFLP引物(新选910对SSR引物,4对AFLP引物)扩增双亲,426对SSR引物、15对AFLP引物能够在双亲中显示出差异,其多态性比率分别为24%与23%。用此多态性引物扩增F2群体,整合前期的遗传图谱上的分子标记,共有531个SSR标记和30个AFLP标记能在F2中显示多态性。分析561个分子标记,最终构建了一个分布于甘蓝型油菜19个连锁群的遗传连锁图谱,该图谱共有532个分子标记,其中SSR标记502个,AFLP标记30个,图谱总长度为1341.1cM,标记间的平均距离为2.52cM。与本实验室前期图谱相比,总长度增长549.036cM,标记间平均距离缩短1.38cM,因此,对耐盐基因定位更加精确。3.耐盐相关基因的QTL定位共45个耐盐相关的QTL被定位到10个连锁群上。其中,有7个QTLs与耐盐等级相关,qSTR1-a和qSTR1-b分布在连锁群1上同一个区域,qSTR8-a和qSTR8-b分布在8连锁群上的同一区域。7个QTLs与叶绿素相关,其中,qSPAD5-b、qSPAD5-c和qSPAD5-a分布于第5连锁群的同一区域,qSPAD5-a表型变异率达到了51.14%。在9个电导率相关的QTLs中,qEC3-a和qEC3-b分布在连锁群3上同一区域,qEC4-a和qEC4-c分布在连锁群4上的同一区域。6个根干重的QTLs中,连锁群1上有两个QTLs,分别为qRDW1-c和qRDW1-a,其余的分布于连锁群4、5、12、19。2个超氧化物歧化酶的QTLs分布在连锁群1与14上。3个可溶性蛋白的QTLs中,有2个(qSP8-b和qSP8-c)分布在连锁群8上的同一区域。3个苗高的QTLs中,qSH12-a和qSH12-b分布在连锁群12的同一区域。2个根长的QTLs分别位于第17与第19连锁群上。3个叶鲜重和叶干重的QTLs,qLDW14-b、qLDW14-c和qLFW14-b定位在连锁群14上的标记MC14EA16_190附近区域。4.耐盐候选基因的初步筛选对LG5上含有3个SPAD相关的QTLs的区域进行了精细定位,该区域位于A07染色体的16.33-23.14Mb之间,在该区域筛选获得了2个与耐盐相关的IP标记,IP05、IP08将该QTL的区间被缩小到了17.41-17.80Mb的一个390Kb的范围,该区域共有66个基因,通过分析每个基因的功能注释,发现有一个基因Bra003640与植物的耐盐性相关,因此,初步将Bra003640作为本研究的一个候选基因。5.耐盐候选基因的结构和表达分析利用同源克隆法在双亲中克隆了Bra003640的同源基因Bn2205和Bn1423,其全长均为1063bp,均含有3个外显子和2个内含子,其ORF均为867bp,编码287个氨基酸,等电点分别为5.99和6.04、分子量为31.34kDa和31.30kDa,该基因存在2个典型的B-Box结构域。利用DNAMAN分析Bn2205和Bn1423的ORF序列,两者存在11处单核苷酸差异,导致了7处氨基酸的变化,其中在保守结构域内存在3个氨基酸的变化。系统发生树结果显示,白菜Bra003640、甘蓝Bol021552、甘蓝型油菜GSBRNA2T00084211001和GSBRNA2T00131912001与目标序列Bn2205和Bn1423聚为一类,亲缘关系较近分析基因的上游序列发现,存在AF1,HD-Zip 1,LTR,HSE等与耐盐相关的顺式作用元件。在不同浓度盐胁迫下,候选基因在根、叶中均受到强烈的诱导。随着时间、盐浓度不同,基因表达量不同。两亲本在l00mmol/L盐胁迫6小时、200mmol/L盐胁迫下,24小时表达量存在极显著差异6.甘蓝型油菜耐盐亲本花叶性状的遗传及基因定位通过田间调查发现,耐盐亲本2205为圆叶,敏盐亲本1423为花叶,F1叶形均为花叶。BC1群体中,圆叶形与花叶形单株的分离比例符合1:1;F2群体中,圆叶形与花叶形单株的分离比例符合1:3,因此推测花叶性状受一对主效基因控制,花叶对圆叶为不完全显性。利用SSR技术筛选花叶基因连锁的分子标记,结果表明3对SSR引物能在亲本及F2群体中显示多态性。连锁分析表明BNGMS114、CB10079和BNGMS385均为基因一侧的分子标记,其遗传距离分别为2.5,3.9,7.1cM,BNGMS385为共显性标记。标记序列的同源性分析表明,3个标记的序列与白菜A10染色体的序列共线性较好,分别位于A10染色体的12.88,14.56,15.70Mb处。
[Abstract]:In this paper , we studied the genetic linkage map of Brassica napus L . Genetic linkage map of 19 linkage groups of Brassica napus was obtained . The correlation coefficients were 0 . 8 and 0 . 213.2 cM , respectively . Genetic and gene mapping of leaf characters of Brassica napus L . was 1 鈭，

本文编号：1909324