烟草microRNA827及其靶基因的鉴定和初步功能研究

发布时间：2018-05-20 01:18

  本文选题：烟草 + 磷　； 参考：《南京农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：磷(Phosphorus,P)是核酸、磷脂和含磷蛋白酶类等生物大分子的重要组成部分,在植物体内的能量转移、信号转导、光合作用等过程发挥了重要作用,因此磷是植物生长发育必需的大量营养元素之一。植物根系从土壤中吸收的主要是无机态正磷酸盐(Pi;inorganic orthophosphate),磷在土壤中非常容易被固定而沉淀,造成其在土壤中的移动性和有效性都很低,因此磷也成为植物生长发育的主要限制因子之一。在长期的进化过程中,植物为适应磷素缺乏的环境形成了相应的适应性机制,包括根系形态结构的改变、植物根际土壤化学性质的改善、与土壤中菌根真菌形成共生体系以及在转录水平对众多基因调控等方式做出相关的适应性调整。在过去的20年里,越来越多的基因被发现参与维持植物的磷素动态平衡,其中microRNAs(miRs)和SPX(S YG1/PH081/XPR1)家族成员发挥着关键作用。MiRs是一类具有20-24个碱基,内源表达的非编码RNA,它是由长的茎环结构前体经过Dicer-like酶剪切而形成的。MiRs通常需要形成沉默复合体(silencing complex)与靶基因的mRNA进行碱基互补配对,对其进行剪切或直接抑制其翻译从而达到调控下游基因的功能。目前,在缺磷信号转导途径中报道的主要有miR399和miR827。研究表明,miRs在不同物种间的保守性很强,但同时又存在一定的变异性。在拟南芥和水稻中,miR827的靶基因分别为属于SPX-RING家族的AtNLA和属于SPX-MFS家族的OsSPX-MFS1/2。表明在不同物种间miR827的靶基因在进化上发生了分离。本工作主要对茄科作物烟草中miR827和其靶基因进行克隆,并围绕其表达模式和维持植株磷稳态方面的生理功能展开研究。所获得的主要结果如下:1.通过生物信息学预测分析并成功克隆到烟草中的miR827。生物信息学分析显示,NsmiR827a/d前体序列可以折叠成典型的茎环结构,且miR827成熟片段位于前体结构的3'端茎结构上。采用荧光定量RT-qPCR对烟草中的miR827进行表达模式分析表明,NsmiR827a/dd在地上部和地下部均响应缺磷胁迫发生上调,这与miR827在拟南芥和水稻中的表达模式是一致的,说明miR827在不同物种间有很强的保守性。2.在miR靶基因预测网站预测获得miR827在本氏烟草(Nicotianabenthamiana)中的两个靶基因,通过同源序列比对和RLM-RACE技术,获得了林烟草中miR827两个靶基因的全长序列。林烟草中miR827的靶基因在N端和C端分别具有一个保守的结构域即,SPX和MFS结构域。通过对miR827的靶基因NsSPX-MFS1和NsSPX-MFS2进行表达模式分析表明,miR827的两个靶基因对缺磷信号表现了完全相反的响应模式,NsSPX-MFS1受缺磷下调,而NsSPX-MFS2则受缺磷上调,且NsSPX-MFS1/2在地上部的表达量均高于根部。3.构建了 miR827的靶基因NsSPX-MFS1/2以及各自MFS结构域融合GFP荧光蛋白的载体,并通过本氏烟草表皮细胞瞬时表达技术对其亚细胞水平的定位进行了分析。结果显示,NsSPX-MFS1/2以及各自的MFS结构域均定位在液泡膜和细胞核,表明MFS结构域对NsSPX-MFS1/2的定位有重要作用。4.在五个主要磷转运蛋白基因突变的酵母突变株EY917中进行了 NsSPX-MFS1/2的功能回补,研究二者在磷转运方面的功能。结果显示,在高磷条件下(10 mM),转入NsSPX-MFS1/2能恢复EY917突变株的表型;而转入NsSPX-MFS1/2各自MFS结构域亦能部分恢复其表型,但其对突变株的回补能力稍弱于具有完整结构的NsSPX-MFS1/2。这些结果表明,NsSPX-MFS1/2的MFS结构域负责磷的转运,同时SPX结构域可能对磷的转运活性也有一定贡献,但其具体的功能及其分子机制还有待进一步深入的研究发掘。5.创制了烟草miR827a/d的过表达株系。在不同磷浓度(100μM,1mM,5mM,10 mM)处理下,与野生型相比,miR827过表达株系在表型、根冠比和可溶性磷浓度方面均没有显著差异。
[Abstract]:Phosphorus ( P ) is an important component of biological macromolecules such as nucleic acids , phospholipids and phosphoproteases , and plays an important role in energy transfer , signal transduction , photosynthesis and so on in plants . NsSPX - MFS1 / 2 and their respective MFS domains were all located in vacuolar membranes and nuclei , indicating that the MFS domains play an important role in the localization of NsSPX - MFS1 / 2 . The results showed that NsSPX - MFS1 / 2 could partially restore the phenotype of the mutant strain NsSPX - MFS1 / 2 .
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S572

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本文编号：1912543