茯苓qRT-PCR内参基因筛选的研究

发布时间：2018-05-21 07:46

本文选题：茯苓 + RNA提取　；参考：《武汉轻工大学》2016年硕士论文

【摘要】：茯苓Wolfiporia cocos是多孔菌科Polyporaceae,茯苓属Wolfporia的地下菌核,在我国常作为药食两用的中药材。近年来,随着分子生物学技术的应用不断拓展,应用现在分子生物技术研究真菌类中药,已成为当前中药真菌的研究前沿。本课题采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对在不同条件下的茯苓内参基因进行筛选研究,以获取合适的内参基因校正目的基因的表达量,为研究茯苓基因的表达调控,揭示茯苓菌核的生物学特性,科学的指导茯苓种植提供了理论依据。本研究选取了10个内参基因:28S核糖体RNA亚基(28S),18S核糖体RNA亚基(18S),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),核糖体蛋白L4(RPL4),真核延伸因子1α(EF1-α),真核延伸因子1β(EF1-β),DNA指导的RNA聚合酶亚基2(RPB2),肌动蛋白(ACT),微管蛋白α(α-TUB)和微管蛋白β(β-TUB)。利用qRT-PCR技术分别检测其在茯苓3个不同生长时期、2个不同组织以及在高盐,高糖和高pH值等逆境条件下菌丝中的表达量,使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种内参筛选软件综合分析,比较10个候选基因的表达稳定性。实验结果如下:1、根据10条已公布的内参基因序列设计引物,通过PCR扩增出10个内参基因片段,在NCBI上经BLAST比对后,发现10个内参基因序列与其他物种同源基因具有高度相似性。2、在传统Trizol法步骤中加入乙酸钠、β-巯基乙醇进行体系优化后,提取茯苓子实体3个不同发育阶段的不同组织以及茯苓菌丝在不同胁迫条件下的总RNA。结果显示,18S和28S两条条带分离清晰,带型整齐。3、geNorm软件分析显示:在茯苓不同生长阶段中,内参基因表达稳定性为:28Sα-TUB18SRPB2GAPDHEF1-αβ-TUBRPL4EF1-βACT;NormFinder软件分析结果为:GAPDH28S18SRPB2α-TUBRPL4EF1-αβ-TUBEF1-βACT;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为28S和GAPDH。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用28S作为内参基因。4、geNorm软件分析显示:在茯苓不同组织中,内参基因表达稳定性为:α-TUBGAPDH28SRPL4EF1-αβ-TUB18SEF1-βRPB2ACT;NormFinder软件分析结果为:28Sα-TUB18Sβ-TUBEF1-αGAPDHEF1-βRPB2RPL4ACT;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为α-TUB和28S。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用α-TUB和28S作为内参基因。5、geNorm软件分析显示:在不同逆境环境中,内参基因表达稳定性顺序为:GAPDHACT28SEF1-αα-TUB18SRPB2β-TUBEF1-βRPL4;NormFinder软件分析结果为:ACT28SGAPDHRPB2EF1α18Sα-TUBEF1-ββ-TUBRPL4;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为GAPDH和ACT。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用GAPDH和ACT作为内参基因。6、geNorm软件分析显示:在茯苓所有样品中,内参基因表达稳定性顺序为:GAPDHα-TUB28SRPB218Sβ-TUBACTEF1-βRPL4EF1-α;NormFinder软件分析结果为:α-TUBRPB228SGAPDH18SEF1αACTβ-TUBRPL4EF1-β;BestKeeper软件分析结果则显示最稳定的内参基因为α-TUB和RPB2。综合三个软件分析得到的结果,推荐使用α-TUB作为内参基因。结论:本课题筛选出的GAPDH、α-TUB基因可以作为研究茯苓基因表达量的稳定内参基因,实验结果为茯苓菌核的种植提供了工作基础。
[Abstract]:In recent years , we selected 10 internal reference genes : 28S ribosomal RNA subunit ( 28S ) , ribosomal protein L4 ( RPL4 ) , eukaryotic extension factor 1伪 ( EF1 - 伪 ) , actin ( ACT ) , microtube protein 伪 ( 伪 - TUB ) and microtubular protein 尾 ( 尾 - TUB ) . The results obtained from three software analyses showed that : 伪 - TUBRPB228SGAPDH18SEF1 - TUBACTEF1 - 尾RPL4EF1 - 伪 ; and BestKeeper software analysis showed that 伪 - TUBRPB228SGAPDH18SEF1 - TUBTEF1 - 尾RPL4EF1 - 伪 was used as the internal reference gene .
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.32

【参考文献】