菰黑粉菌α基因的克隆及功能研究

发布时间：2018-05-21 10:50

  本文选题：菰黑粉菌 + 原生质体转化　； 参考：《中国计量大学》2016年硕士论文

【摘要】：菰黑粉菌(Ustilago esculenta)可以侵染茭白植株并刺激其基部膨大形成可食用茭白。研究发现,菰黑粉菌存在菌丝型、酵母型两种型态；而在玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)中,酵母型没有致病性,而菌丝型具有致病性并侵染玉米植株；目前认为菰黑粉菌二型态转换与茭白的形成密切相关,而遗传交配“位点在多种黑粉菌属真菌中被证实调控真菌的二型态的转换,且主要由“位点上mfa、pra基因协同作用。菰黑粉菌的基因组测序结果显示其存在mfas pra的同源基因,但是其a位点的结构以及在调节菰黑粉菌二型态转换过程中的分子机制尚未见研究报道。本研究以分离得到的菰黑粉菌性亲和单倍体(UeT14、UeT55、UeMT10、UeMT46)为实验材料,从分子生物学角度研究菰黑粉菌中a位点的结构及其功能,明确a位点上的mfa、pra基因对菰黑粉菌真菌二型态转换的调节作用。首先以UeT55单倍体菌株为实验材料,通过对酶解条件、稳渗剂、再生培养基、载体、抗性筛选标记的优化筛选,建立并优化了PEG介导的菰黑粉菌遗传转化体系,为菰黑粉菌基因功能研究提供了实验基础。结果表明：菰黑粉菌在15 mg/mL Lywallzyme酶解液中,以山梨醇或蔗糖为稳渗剂于30℃下酶解3 h,原生质体产率达到最大值,在以山梨醇或蔗糖为稳渗剂的再生培养基上培养可得到较高的转化效率；同时研究发现线性化的外源DNA才能导入菰黑粉菌,且最佳的抗性筛选标记为潮霉素和萎锈灵。同时根据菰黑粉菌全基因组序列信息和已报道的a基因结构特征,设计特异性引物进行长片段克隆,分别对UeMT10、UeMT46、UeT14、UeT55四个菌株的“位点进行了克隆及生物信息学分析,结果表明：菰黑粉菌存在3个a等位基因a,、a2、a3,且每个a位点上存在两个信息素基因(mmfa),一个信息素受体基因(pra),其中UeT14菌株中为a1,包含mfal.2、 mfa1.3、pral; UeT55、UeMT46菌株中为a2,包含mfa2.1、mfa2.3、pra2；UeMT10菌株中为a3,包含mfa3.1、mfa3.2、pra3;而且菰黑粉菌a位点基因与玉米瘤黑粉菌、玉米丝黑穗病黑粉菌(Sporisorium reilianum)等具有较高的同源性,说明a基因可能在菰黑粉菌中也负责调节真菌二型态转换信号。因此我们以UeT55为实验材料,进一步通过PEG介导的原生质体转化方法分别敲除菌株中的mmfa或pra基因,研究mmfa或pra基因对菰黑粉菌二型态转换的调控机制。试验采用UeT14-Δmaf1.2、UeT14-Δmfa1.3、UeT14-Δpra1、UeT55-Δmfa2.1、UeT55-Δmfa2.3、UeT55-Δ pra2基因缺失菌株进行体外融合试验,结果表明：当mfa1.2-pra2、mfa2.1-pra1两对信息素-信息素受体基因同时存在时(野生菌株或mfa1.3/mfa2.3基因缺失菌株体外融合培养),菰黑粉菌性亲和菌株UeT14和UeT55可以生长芽管并通过芽管进行细胞融合继而生长菌丝；当只有一对信息素-信息素受体基因mfa1.2-pra2或mfa2.1-pra1存在时,菰黑粉菌菌株UeT14和UeT55混合培养下可以生长芽管,但是无法进一步进行细胞融合和菌丝生长；当mfa1.2-pra2和mfa2.1-pra1两对信息素-信息素受体基因中各缺失一个以上基因时,菰黑粉菌菌株UeT14和UeT55既不生长芽管,也无法进行细胞融合和菌丝生长。同时我们通过实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)对基因表达水平进行检测,比较分析上述进行体外融合试验的菰黑粉菌菌株中未缺失的a基因表达模式以及a基因下游途径基因(Uegpa3、Ueubc2)的动态表达,研究a基因在菰黑粉菌二型态转换中的信号调控机制。试验首先根据菰黑粉菌全基因组信息克隆了Uegpa3、Ueubc2基因并通过体外融合试验确认它们调控菰黑粉菌菌丝融合生长过程。进一步的qRT-PCR结果显示：在体外融合过程中,与野生型菌株相比,当mfa1.2-pra2和mfa2.1-pra1两对组合中任何基因缺失时,其它mfa、pra基因的表达受到不同程度的影响；当mfa1.3、mfa2.3缺失后对其它mfa、pra基因表达水平没有明显的变化,表明mfa1.2-pra2、mfa2.1-pra1基因共同参与调节菰黑粉菌的细胞融合及菌丝形成的信号途径。同时对融合组合中Uegpa3、 Ueubc2基因表达量进行检测,发现有菌丝或芽管生长的融合组合中,其Uegpa3、Ueubc2基因表达分别在芽管生长初期和菌丝生长后期表达量相对较高,且趋势基本一致；而在菌落为酵母型且无芽管生长的组合中,Uegpa3、Ueubc2基因表达变化未能呈现明显的规律性。说明Ueubc2、 Uegpa3基因参与mfa、pra基因调节的菰黑粉菌二型态转换,但是两者之间的关系需要更多实验进一步证明。
[Abstract]:Ustilago esculenta could infect Zizania caduciflora and stimulate its base to expand to form edible Zizania latifolia .
However , in Ustilago maydis , there was no pathogenicity in the yeast type , while the mycelium was pathogenic and infected with maize plants .
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本文编号：1918892