牛分枝杆菌MPB83-70融合蛋白基因重组乳酸菌的构建及免疫研究

发布时间：2018-05-27 06:21

  本文选题：牛分枝杆菌 + MPB83-70融合蛋白基因　； 参考：《吉林农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：实验目的:牛结核病是一种能够严重威胁到人类的食品健康安全及经济安全的人兽共患传染病,近几年来疫情蔓延迅速,发病率逐年增长。目前,唯一可用牛结病疫苗仍然是卡介苗(BCG),但由于对牛群的免疫效果不理想,因此,研究者们正极力研制出高效的牛结核病疫苗。MPB83、MPB70是牛分枝杆菌早期分泌蛋白,也是目前研究最多的蛋白。将MPB83、MPB70蛋白基因融合在一起,可以在很大程度上提高对于牛结核病的防御效果,作为诊断性抗原时,具有很高的特异性和灵敏度。因此,将MPB83-70融合基因作为本实验的靶基因对研发牛结核病疫苗具有深远意义。乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900被称为食品安全级微生物,又是肠道益生菌,其抗原性较弱、不产生胞外酶,筛选时无需抗生素筛选标记,是疫苗研发中天然的递呈外源抗原载体,已成为疫苗研发、生物制药等领域的研究热点。因此,本文将以pNZ8149/NZ3900作为表达载体,表达牛分枝杆菌MPB83-70融合基因,以构建出重组乳酸乳球菌,并对该重组菌的免疫指标进行测定,为制备牛结核病疫苗提供理论参考。试验方法:以质粒mpb83-70x作为PCR模板,对目的基因mpb83-70进行PCR扩增并与pMD18-T Simple Vector进行连接,构建出克隆质粒pMD18-T(S)-mpb83-70。将其用KpnⅠ、NcoⅠ进行酶切,回收得到的目的基因mpb83-70与表达载体pNZ8149/NZ3900进行连接,以电击转化方式导入到乳酸菌感受态内,涂于含乳糖及溴甲酚紫的ELLKEI固体筛选培养基上,长出的黄色菌落初步判定为阳性菌pNZ8149-83-70/NZ3900。经Nisin诱导,SDS-PAGE及间接免疫荧光鉴定,乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900表达37kDa mpb83-70目的蛋白。随后,将pNZ8149-83-70/NZ3900重组乳酸菌免疫小鼠,利用流式细胞术对免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞以及IL-2、TNF-α、IFN-γ细胞因子数量进行检测,再应用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)以及Mouse sIgA ELISA Kit试剂盒检测免疫小鼠血清内的特异性IgG和粪便上清液中sIgA水平,最后利用统计学分析方法对得到的数据概括分析。实验结果:1、通过PCR技术,成功扩增出目的基因mpb83-70,与大肠杆菌克隆载体pMD18-T Simple Vector进行连接,酶切回收后得到了mpb83-70克隆基因;2、目的基因mpb83-70与表达载体pNZ8149/NZ3900连接后经过双酶切鉴定,成功构建了重组乳酸菌pNZ8149-83-70/NZ3900。经SDS-PAGE及间接免疫荧光验证,重组乳酸菌表达37kDa的外源蛋白;3、利用流式细胞仪检测免疫小鼠体内CD3+T淋巴细胞的数目高于空载pNZ8149组和0.9%NaCl组,但低于BCG组。四组之间差异均不显著(P0.05)。免疫小鼠体内产生的CD4+T淋巴细胞的数目略低于BCG组但差异并不显著(P0.05),与空载pNZ8149/NZ3900组和PBS组相比较,重组乳酸菌产生的CD4+T淋巴细胞数目较高且差异显著(P0.05)。CD8+T淋巴细胞数量略低于BCG组差异不显著(P0.05),但高于空载pNZ8149/NZ3900组和PBS组且差异显著(P0.05)。流式细胞仪检测免疫小鼠淋巴细胞产生IL-2的细胞数量高于BCG组及空载pNZ8149/NZ3900组,但差异不显著(P0.05),BCG组数值高于空载pNZ8149/NZ3900组及PBS组,但差异不显著(P0.05)。产生IFN-γ的细胞数小于BCG组且差异不显著(P0.05),但同其他两组对比数值偏高且差异不显著(P0.05)。分泌TNF-α的细胞数小于BCG组,高于pNZ8149/NZ3900组及PBS组,且差异都不显著(P0.05)。应用ELISA对免疫小鼠血清中IgG抗体进行检验,结果表明重组乳酸菌pNZ8149-83-70/NZ3900组数值低于BCG组,高于空载pNZ8149/NZ3900组及PBS组,且差异都不显著(P0.05)。利用Mouse sIgA ELISA Kit检验免疫小鼠粪便内sIgA抗体水平,结果表明:pNZ8149-83-70/NZ3900组数值高于BCG组、空载pNZ8149/NZ3900组及PBS组且差异显著(P0.05),由此可以证实pNZ8149-83-70/NZ3900可以引起局部黏膜免疫应答反应,并能够诱发免疫小鼠产生较好的sIgA抗体。综上所述,流式试验及ELISA试验统计学分析结果显示出重组乳酸乳球菌pNZ8149-83-70/NZ3900具有免疫原性,可以为牛结核病疫苗的后续研究提供理论依据。
[Abstract]:In this paper , the fusion gene of MPB83 - 70 ( MPB83 - 70 ) was used as the expression vector to construct the recombinant plasmid pMD18 - T ( S ) - mpb83 - 70 . The recombinant strain MPB83 - 70 was used as an expression vector to construct the recombinant plasmid pMD18 - T ( S ) - mpb83 - 70 . IFN-纬缁嗚優鍥犲瓙鏁伴噺杩涜�屾＃�

本文编号：1940813