玉米RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子活性鉴定与Waxy1基因编辑

发布时间：2018-05-27 07:26

本文选题：玉米 + CRISPR-Cas9　；参考：《安徽农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：基因组编辑是一种新近发展的在受体基因组中人工定向产生插入、删除和替换等突变的技术。基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的基因编辑技术因操作简便、设计灵活和突变效率高等特点,成为基因编辑的主流技术,并在玉米等高等植物定向遗传改良提供了新途径。然而,玉米中可用于表达sg RNA的polⅢ启动子未得到系统鉴定,限制了CRISPR-Cas9技术在玉米中的应用。本研究拟建立一套玉米瞬时表达系统,用以系统评估玉米多个RNA polⅢ启动子在CRISPR-Cas9技术系统中的活性,为高效玉米基因编辑技术体系提供关键遗传元件,并基于鉴定的高活性的RNA polⅢ启动子建立了玉米CRISPR-Cas9基因编辑技术体系,应用于玉米ZmWaxy1基因的基因敲除编辑。主要研究结果如下:(1)建立了一套稳定高效的玉米瞬时表达系统。以郑58、B73、中单99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品种(系)的二叶期叶片为材料,采用酶解法进行了玉米叶肉细胞原生质体制备,获得的原生质体细胞通过FDA染色镜检,结果表明,基于本技术体系可以高效制备郑58、B73、中单99、自交系Black Mexican Sweet(BMS)等品种的高活性叶肉细胞原生质体。通过对PEG介导的外源表达Ds Red-2标记基因表达载体试验对PEG浓度等参数进行了优化,结果表明,最佳转化效率的PEG浓度为45%。本研究建立了转化效率高达80%的玉米叶肉细胞原生质体的技术体系。(2)建立了高效的CRISPR-Cas9基因编辑离体The Traffic Light Reporter(TLR)报告系统。本研究中TLR报告系统设计由两个串联的移码突变的e GFP和Ds Red报告基因,依据CRISPR-Cas9系统特点在设计的TLR系统前加入一段CRISPR-Cas9系统识别序列作为突变位点。在原生质体中当TLR系统被CRISPR-Cas9编辑后,引入的突变可以分别引起移码e GFP和Ds Red报告基因回复突变,并分别在胞内显示绿色与红色荧光,从而流式细胞计数统计突变率。(3)玉米RNA PolⅢ启动子分离及其CRISPR-Cas9活性鉴定。于玉米全基因组中搜寻U6 sn RNA所在物理位置,取基因上游400-500 bp为U6 sn RNA潜在的启动子序列,通过比对筛选我们共找到6个潜在的玉米U6 sn RNA启动子。采用PCR法成功分离这6个预测的启动子,并基于本研究建立的高效瞬时表达系统与离体的TLR报告系统,鉴定了这些启动子的CRISPR-Cas9活性,鉴定出玉米中高活性的RNA PolⅢ启动子,并用于CRISPR-Cas9后续试验。(4)以ZmWaxy1基因为基因编辑的目标基因,选择该基因ZmWaxy1基因的第7外显子上构建了人工定向编辑CRISPR-Cas9载体。(5)ZmWaxy1基因敲除基因编辑。通过农杆菌介导法,对玉米进行CRISPR-Cas9基因编辑载体的稳定遗传转化。采用PCR法筛选得到36个稳定转化株系,通过对T0代植株测序并对靶基因目标区域进行了基因突变分析统计,结果表明,36株转基因植株中,纯合突变为13株,双等位基因突变12株,杂合突变0株,野生型1株,突变率为97.22%。将T0代与野生型植株进行杂交得到T1代籽粒,所得到的籽粒经过碘染色大部分表现出糯性性状特性,表明CRISPR-Cas9在子代中表现出了较高的编辑效率。T0、T1代籽粒胚乳淀粉粒与花粉经过固定后进行碘染色通过显微镜观察表明,糯性性状表型可靠,且遗传稳定。结果表明,本研究建立了玉米CRISPR-Cas9高效基因敲除编辑技术体系。
[Abstract]:In this study , we have established a system for gene editing of maize leaf - meat cells with high efficiency . The results show that the gene - editing technology of maize leaf - meat cells is based on the characteristics of simple operation , flexibility and high mutation efficiency . ( 3 ) The expression of CRISPR - Cas9 in maize was determined by PCR . The results showed that the expression of CRISPR - Cas9 gene was higher than that of wild - type plants .
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S513

【参考文献】