安徽地区PEDV S基因序列分析及间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-06-02 07:51

本文选题：猪流行性腹泻病毒 + S基因　；参考：《安徽农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病。该病在1971年首次报道于英国,1976年我国也证实了本病。目前,PED已经成为影响全球养猪业最为严重的病毒性传染病之一,给养猪业造成了重大经济损失。近几年,我国PED的发病率、死亡率均呈上升趋势,尤其是自2010年10月以来,PED在我国的流行广泛并呈现新的特点。感染PEDV后,哺乳仔猪死亡率达80%-100%,而繁殖母猪和公猪则很少表现出临床症状。病毒的变异可能是引起PED大规模爆发的原因,这给本病的防治带来了新的挑战。因此对于PEDV基因遗传进化的分析以及建立一种快速、可靠的PEDV抗体检测方法,进行PED流行病学的监测以及猪群免疫过PED疫苗后抗体水平的检测,对于本病的预防具有重要意义。本研究内容包括以下部分:1:安徽地区PEDV S基因遗传进化分析为分析2014-2015年安徽地区猪流行性病毒(PEDV)的变异情况,本研究设计合成3对特异性引物,对2014-2015年采集自安徽省12个地级市21个不同地区发生腹泻的猪场,经检测为PEDV阳性的病料,对这21株PEDV毒株的S基因全基因序列测序,并对其进行遗传进化分析。结果表明,21株PEDV安徽地区毒株除AHBB-1外,20株PEDV安徽地区毒株S基因全长均为4161bp。21株PEDV S基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%-99.9%和96.0%-99.8%;与经典CV777株核苷酸和氨基酸同源性分别为93.7%-95.9%和92.6%-96.8%。21株安徽毒株除AHBB-1株外,其他20株S基因均存在相同的插入和缺失,这些位点核苷酸的插入和缺失导致了其编码的氨基酸相应改变。S基因系统进化树分析结果表明,21株安徽毒株除AHBB-1外20株处于同一分支,且与2011-2012年的6株中国其它地区毒株、2014年的2株中国其他地区毒株、2005-2009年3株韩国毒株亲缘关系均较密切,而与欧洲株(CV777、Brl)、中国现用疫苗株(CV777-vaccine)及中国早期分离株CH/S亲缘关系均较远。S蛋白抗原位点分析表明,安徽分离株与现用疫苗株(CV777-vaccine)相比,流行毒株S蛋白的主要抗原位点及COE区域均发生了变异。2.间接ELISA检测方法的建立利用生物学软件分析PEDV S蛋白抗原位点,选择编码亲水性较强、抗原指数较高且表面可及性好的区域,针对这个区域设计一对特异性引物,以PEDV基因组反转录后c DNA为模板进行扩增,扩增产物回收、纯化后克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达重组载体p ET-32a-S,经重组质粒转化至表达菌BL21中进行诱导表达,以SDS-PAGE蛋白电泳鉴定是否表达及表达形式;以Western-blot鉴定重组蛋白的免疫活性。摸索重组S蛋白的最佳表达条件,对重组蛋白S进行纯化,用纯化后的S蛋白作为包被物,建立PEDV抗体间接ELISA检测方法,并与进口商品化PEDV抗体试剂盒和Western-blot金标准进行对比试验,比较二者的符合率、敏感性和特异性。结果表明:本研究成功扩增出所需S基因片段并构建重组载体p ET-32a-S,诱导表达出重组S蛋白,经Western-blot分析验证具有良好的反应原性。通过对建立间接ELISA检测方法的优化,最终确定反应的最佳蛋白包被浓度为8mg/L,封闭液为2%BSA,一抗的最佳稀释度为1:40,最佳作用时间为30min,羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度1:1500稀释,最佳作用时间为45min,显色时间为10min。重复试验表明组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。与进口商品化PEDV抗体检测试剂盒相比符合率、敏感性和特异性为86.67%、89.83%、82.62%;与western-blot检测结果相比,符合率、敏感性和特异性88.89%、90.20%、83.33%。结果表明:以表达的重组S蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法特异性高、变异性小、符合率高。可用于生产中PEDV抗体水平的检测。
[Abstract]:In recent years , the genetic evolution of PEDV S gene in Anhui region has become one of the most serious infectious diseases in China . The recombinant plasmid pET - 32a - S was cloned into prokaryotic expression vector pET - 32a ( + ) by Western - blot . and can be used for detecting the level of PEDV antibody in production .
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】