干扰Fign基因表达对大鼠星形胶质细胞迁移的影响及机制研究

发布时间：2018-06-09 04:41

本文选题：Fidgetin(Fign) + Kinesin-12　；参考：《南通大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的:微管的聚合与解聚在许多生物过程中起着重要的作用,如细胞的分裂、迁移、膜骨架的重构等。Fidgetin(Fign)是一种微管依赖的切割蛋白,可以通过调控微管的动态变化来促进有丝分裂染色体的分离。之前的研究发现,Fign在终末分化的神经元中也存在表达,可以通过调控微管的运动和组装,参与神经发育。然而关于Fign蛋白发挥功能的位置、方式及其分子机制尚未清楚,甚至是否在神经系统的其他类型细胞中表达目前还未知。在本研究中,我们采用离体培养的大鼠脊髓星形胶质细胞,通过干预Fign表达,观察Fign蛋白对大鼠脊髓星形胶质细胞迁移的影响及其可能地分子机制。方法:分离提取大鼠生后发育不同时间脊髓组织总蛋白,采用Western bloting方法检测微管切割蛋白Fign和Spastin表达变化。分离获取出生后1天大鼠脊髓星形胶质细胞,纯化培养传至第二代(P2),转染Fign si RNA敲降其表达。采用Ed U方法检测对细胞增殖的影响,采用Transwell、划痕实验及活细胞动态观察等方法检测对细胞迁移的影响,采用q RT-PCR、Western-Bloting、免疫荧光细胞化学(IF)方法检测Fign在细胞中定位及含量变化;通过si RNA/IF及Overexpression/IF方法检测细胞中微管骨架的变化。结果:1.通过Western-Bloting方法检测,在大鼠生后发育过程中,其脊髓组织中Fign和Spastin蛋白表达均呈下降趋势。2.在体外培养的星形胶质细胞转染Fign si RNA作用3d后,检测对细胞迁移和增殖的影响,结果表明:与转染对照si RNA相比,敲降Fign表达后,星形胶质细胞的迁移能力显著下降,而细胞增殖未受到明显影响。3.在星形胶质细胞中敲降Fign表达后,进行IF检测,结果显示:与对照si RNA相比,Fign si RNA处理组的星形胶质细胞中微管在细胞皮质区处发生了明显的转弯(curling)。4.采用微管蛋白翻译后修饰的不同抗体进行Western Blotting和IF检测,结果表明:在星形胶质细胞中干扰Fign表达,酪氨酸化的微管蛋白量升高,反之若过表达Fign,酪氨酸化的微管蛋白量下降。5.我们之前已经证明微管依赖的马达蛋白Kinesin-12表达下调可以促进星形胶质细胞迁移,当在星形胶质细胞中同时敲降Fign和Kinesin-12表达时发现,Fign表达下调导致的细胞迁移抑制可以被部分解除。结论:随着大鼠生后发育成熟,脊髓组织中微管切割蛋白Fign和Spastin蛋白表达量逐渐下降,提示脊髓组织中的微管稳定性逐渐增强。在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞中微管切割蛋白Fign偏好作用于动态不稳定酪氨酸化的微管蛋白;若下调Fign蛋白的表达水平可以显著抑制细胞的迁移,其原因可能是由于切割蛋白失功能,微管延伸能力增强,但受到细胞膜限制(即皮质区actin逆行流限制),微管在细胞皮质区边缘处的走向发生改变,原来垂直于细胞膜边缘的微管发生沿着细胞膜边缘的弯曲;而当同时抑制微管依赖的马达蛋白Kinesin-12表达时,kinesin-12对微管的限制作用减弱,表现为更多微管垂直于细胞膜边缘,原来被抑制的细胞迁移被部分解除。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Fign protein on proliferation of rat spinal cord astrocytes by means of Western Blotting and Western Blotting . The expression of Fign and Kinesin - 12 in spinal cord tissue of rat spinal cord tissue was decreased .
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q42

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