Streptomyces lavendulae gCLA4基因功能预测和外泌蛋白的生防功能初探

发布时间：2018-06-15 02:22

本文选题：Streptomyces + lavendulae　；参考：《西北农林科技大学》2017年硕士论文

【摘要】：Streptomyces lavendulae gCLA4是从黄瓜叶片分离到的一株内生放线菌,室内及田间试验均表明其能抑制多种病原菌的生长,有良好的生物防治功能。为揭示gCLA4生防机理,探究其生物活性物质,也为生物农药的创制奠定基础。本研究对gCLA4的基因功能进行预测,选取gCLA4外泌蛋白中所有氨基酸数大于100小于1000的94个未知功能蛋白和可能有生防活性的8个功能蛋白chitosanase(278)、chitinase(3253、4025、4203、5554)、chitin-binding protein(1879)、ricin b lectin(2380)、necrosis-inducing protein(4955)共102个蛋白进行原核表达,通过注射烟草检测蛋白是否能引起烟草过敏反应,并通过皿内对峙试验检测粗蛋白液的抑菌活性。得到以下结果:(1)gCLA4基因组大小约为7.59 Mb。基因序列GC含量达72.36%。全基因组共6906个编码基因,其总长度占基因组全长的86.83%。gCLA4基因序列与GO、COG、KEGG、NR数据库比对,各有978、2363、2852、6634个基因得到功能注释。gCLA4基因组序列经antiSMASH分析共得到24个次级代谢生物合成基因簇,其中6个与已知基因簇相似度100%,1个相似度87%,可能合成Streptothricin、Coelichelin,具有抑菌活性。通过预测gCLA4基因组信息,共得到271个分泌蛋白,占全基因组的3.9%。其中104个蛋白有功能描述。(2)本研究对gCLA4中上述102个蛋白去信号肽后在E.coli BL21(DE3)中进行表达,用载体pET-28a表达得到12个可溶性表达的蛋白,用载体pCold TF使74个蛋白得到可溶性表达。最终获得可溶性表达的蛋白86个。这86个蛋白对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae)、苹果树腐烂病菌03-8(Valsa mali 03-8)等靶标菌均无抑菌活性。Necrosis-inducing protein4955能引起烟叶过敏反应,其余均无活性。(3)利用Protparam预测蛋白4955(necrosis-inducing protein)基本性质,用SWISS-MODLE模拟三维结构,并探究蛋白4955稳定性。通过检测蛋白4955处理后,烟草CAT、SOD、POD、PAL酶活变化和烟草防御反应基因PR1-a、PR1-b、NPR1、LOX、PAL表达量探究其活性。结果表明蛋白4955含有225个氨基酸,分子量24491.12;等电点5.96。含保守结构域NPP1。耐受温度40℃,耐受pH 6-10,原蛋白5倍稀释液有活性,10倍稀释液活性较弱。蛋白4955在处理烟草后第2 d,烟草的CAT、SOD、PAL酶活增强,第1、3、5 d烟草PR1-b、LOX基因上调表达,第4 d PAL基因上调表达。表明蛋白4955能诱导烟草产生抗性。(4)壳聚糖酶278、几丁质酶3253、4025、4203、5554、几丁质结合蛋白1879各由255、533、576、754、574、172个氨基酸组成,分子量分别为27540.71、53830.43、60100.10、80762.58、59326.23、18571.79,等电点分别为5.86、5.57、5.80、6.00、5.90、8.72。壳聚糖酶278含糖基水解酶46家族结构域;几丁质酶3253、4025、5554为18家族几丁质酶,均含有糖基水解酶家族18结构域,几丁质结合结构域和纤连蛋白III型结构域;几丁质酶4203同时含有糖基水解酶家族18 II型几丁质酶结构域和19家族ChiC结构域及ChiC结合结构域;几丁质结合蛋白1879含有溶解性多糖单加氧酶(LPMO-10)结构域。几丁质结合蛋白与1%胶体几丁质40℃反应24 h后,约有24.5%的几丁质结合蛋白与几丁质结合。壳聚糖酶278、几丁质酶3253、4025、5554对壳聚糖及几丁质无降解活性。
[Abstract]:The results were as follows : ( 1 ) The genome size of gCLA4 was about 7.59 Mb . The results were as follows : ( 1 ) The genome size of gCLA4 was about 7.59 Mb . The results showed that protein 4955 contained 225 amino acids , molecular weight of 244912 , PAL enzyme activity and the expression of PAL gene . The results showed that protein 4955 contained 225 amino acids , molecular weight of 244912 , isoelectric point 5.96 .
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S476.1

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