脑肠肽促进小鼠异基因骨髓移植后中枢T细胞重建的初步研究

发布时间：2018-06-17 12:51

本文选题：造血干细胞移植 + 中枢免疫　；参考：《南方医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的异基因造血干细胞移植(allo-HSCT, allogeneic hematipoietic stem cell transplantation)是治疗多种血液系统肿瘤、骨髓衰竭、遗传性疾病和某些实体瘤的有效手段。自从20年代50世纪,第一例造血干细胞移植开始,前前世界上移植病例数已超过一百万。随着对人类白细胞抗原(HLA, human leukocyte antigen)的认识和配型技术的发展,对移植物抗宿主病(GVHD, graft-versus-host disease)和移植物抗白血病(GVL, graft-versus-leukemia)效应的认识,以及对移植相关毒副作用和并发症防治的研究,移植技术有了显著的进步,使白血病患者的长期生存达到40%-60%。但是异基因造血干细胞移植后免疫重建延迟(特别是中枢免疫重建延迟)引起的免疫缺陷导致移植后机会感染和移植后白血病复发,严重影响了造血干细胞移植的长期疗效。凶此如何加快移植后免疫重建,缩短移植后免疫缺陷时间以及减少移植后复发是甬需解决的问题。异基冈造血干细胞移植后免疫重建可分固有免疫重建和适应性免疫重建两个方面。固有免疫重建包括自然杀伤细胞(NK, natural killer cell)功能的恢复以及树突状细胞(DC)等对抗原处理及提旱的功能恢复；适应性免疫重建包括T细胞、B细胞的数量和功能的恢复。NK细胞在异基因造血干细胞移植后出现最早,移植后的1-2个月可恢复至移植前水平,CD56brightCD16dim细胞是NK恢复早期的主要亚群。B淋巴细胞的重建时间仅次于NK细胞,数量恢复一般需2-8个月,分泌免疫球蛋白(lg, immunoglobulin)的功能恢复需要1-2年。T淋巴细胞恢复缓慢,CD8+T细胞数量及功能恢复,一般需2-8个月；CD4+T细胞的重建最慢,一般需要1-2年时间才能完全恢复,甚至需要更长的时间。胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官,主要负责产生和输出初始T淋巴细胞,在移植后T细胞免疫重建具有重要作用。骨髓造血干细胞分化成淋巴前体细胞,通过血液迁移至胸腺后成为胸腺细胞；随后在迁移至被膜下皮质区的过程中分化成为三阴性淋巴细胞(TNC, triple-negative cell)。TNC在胸腺皮质区域中发生T细胞抗原受体(TCR, T cell receptor)重排,变成了具有CD4和CD8表面受体的双阳性细胞(DP, double-positive)。此后DP细胞迁移至皮髓质交界区,经过阳性和阴性选择,转变为两种单阳性T细胞(SP, single-positive),并使得T细胞获得了识别非己抗原的能力。经过这个发育过程,最后只有约5%的细胞发育成熟为新生初始T淋巴细胞并输出至外剧的淋巴器官中,但是这些新生初始T淋巴细胞却在机体细胞免疫的活动中发挥着至关重要的作用。由胸腺上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、胸腺基质细胞和细胞外基质构成特定三维结构的胸腺微环境对T细胞的发育起关键作用。其中胸腺上皮细胞是胸腺微环境特定三维结构的丰要细胞,包括皮质胸腺上皮细胞(cTECs, cortical thymic epithelial cells)和髓质胸腺上皮细胞(mTECs, medullary thymic epithelial cells),它们与胸腺T细胞直接接触并提供必要的刺激信号,从而促进胸腺T细胞的发育。由此可见,胸腺(尤其是胸腺上皮细胞)功能在T细胞免疫重建中发挥及其重要的作用。胸腺对免疫损伤十分敏感,大剂量放疗、化疗、免疫抑制剂的使用和GVHD均使胸腺损伤,导致胸腺萎缩,影响初始T细胞的产生。经X射线伞身照射后的小鼠,胸腺皮质和髓质上皮细胞数量明显减少,导致胸腺T细胞发育所需的细胞因子和趋化因子的分泌明显减少,从而影响胸腺T细胞的发育。清髓性的预处理方案可能是通过改变胸腺基质细胞功能,使移植后胸腺输出淋巴细胞的数量与质量明显下降。GVHD可引起胸腺细胞的减少以及基质细胞成分的改变,从而影响胸腺T淋巴细胞的发育、分化及输出功能。移植后预防及治疗GVHD使用的大量免疫抑制药物,也可损伤胸腺,导致T细胞功能缺陷。随着年龄的增长,骨髓中的造血干细胞的多能性及分化能力降低,淋巴祖细胞减少,加.上胸腺的增龄性退化,尤其是髓质部分的萎缩,使得老年患者的适应性免疫应答减弱,加上各项免疫功能的退化以及移植前放化疗等免疫损伤,造成其胸腺输出T细胞功能较年轻患者明显下降,免疫重建明显延迟。目前异基因造血干细胞移植后改善和提高胸腺功能的治疗策略主要有细胞因子、激素及细胞治疗三个方面。角化生长因子(KGF, keratinocyte growth factor)通过与胸腺上皮细胞上的KGF受体相互作用,提供了生长所需的trophic信号,从而改善对T细胞生长非常重要的胸腺的微环境而起到促进免疫重建的作用。IL-7是一种促进淋巴细胞增殖的细胞因子,通过促进早期胸腺祖细胞的增殖,改善免疫重建的速度和程度。生长激素(GH, growth hormone)在移植小鼠的模型中可增加胸腺细胞密度、增加胸腺上皮细胞数量、保护骨髓免受放射损伤、延迟胸腺萎缩和增加T细胞输出而起到改善免疫重建的作用。胰岛素样牛长因子-1(IGF-1, insulin-like growth factor)和牛长激素促分泌物(GHSs, growth hormone secretagogues)可能是通过促进生长激素释放从而促进胸腺上皮细胞增殖而改善免疫功能重建。向移植后患者输注前体T细胞可增加胸腺密度,促进胸腺基质再生,提高T细胞嵌合度并改善外周T细胞和NK细胞重建。脑肠肽(Ghrelin)是迄今发现的唯一生长激素释放激素受体(GHS-R, growth hormone secretagogue receptor)的内源性配体,有很强的剂量依赖性促生长激素释放作用,通过GH-IGF1分泌轴影响胸腺功能；Ghrelin可与T细胞、B细胞、单核细胞等免疫细胞上的GHS-R结合,起到控制和调节细胞凶子分泌、免疫细胞活化、运输和凋亡等作用。在老年小鼠模型中,注射Ghrelin可增加胸腺上皮细胞数量,减少脂肪细胞；增加早期胸腺祖细胞、多能干细胞的数目；增强胸腺近期输出功能,提高TCR的多样性和CD4+、CD8+T细胞生成。Ghrelin在免疫调节及胸腺功能方面具有秋极作用,在免疫重建方面有非常好的应用前景。异基因造血干细胞移植后感染、复发和GVHD,是威胁患者长期生存的主要因素,这些均与免疫重建的延迟密切相关,尤其是T细胞免疫重建延迟,然而胸腺功能是T细胞免疫重建的关键环节,国内外学者针对如何加快移植后胸腺功能免疫重建提出了不同的策略。其中Ghrelin在免疫调节及胸腺功能方面具有积极作用,能够促进老年小鼠胸腺功能的重建。Ghrelin可以增加老年小鼠胸腺细胞数量,显著改善胸腺结构使胸腺皮质与髓质分界更清楚,显著减少胸腺脂肪细胞,增加胸腺皮质和髓质上皮细胞数量,增加胸腺早期祖细胞、多能干细胞、增加胸腺输出功能、改善CD4+T、CD8+T细胞的TCR多样性,通过改善上述各个方而使老化胸腺恢复青春,重建免疫功能。虽然Ghrelin对胸腺功能的研究主要集中在老年小鼠上,对异基因造血干细胞移植后免疫重建研究不不多,但是这种对胸腺以及T细胞的重建作用能否同样出现在异基因造血干细胞移植后的免疫重建上?是否通过GH发挥作用?与GH促进移植后免疫重建有何不同?这些问题都尚未得到解答。因此本实验通过建立同种异基因小鼠的骨髓移植模型,在移植前后不同时间注射Ghrelin,测定移植后不同时间点胸腺指数、脾脏指数、T细胞各亚群(CD4+/CD8+)数量和T细胞受体删除环(TREC, T-cell receptor excision circle)表达量,初步探究Ghrelin对异基因骨髓移植后小鼠T细胞免疫重建特别是中枢免疫重建的影响。研究方法1.建立同种异基因清髓性骨髓移植模型供鼠为C57BL/6小鼠(H-2Kb),受鼠为BALB/c小鼠(H-2Kd)。首先摸索出最小的清髓性辐射剂量,之后以此辐射剂量作为骨髓移植前的预处理；然后摸索出输注骨髓细胞的最佳数量,以此作为骨髓移植细胞量,检测骨髓嵌合率及观察有无GVHD发生,建立同种异皋因清髓性骨髓移植模型。2.在异基因骨髓移植模型的基础上进行实验,实验分为三组,移植前脑肠肽组(GG组)：骨髓移植前7天(-7d)起每日腹腔注射0.2ml (20μg) Ghrelin至移植后第28天；移植后脑肠肽组(PG组)：骨髓移植前7天至移植当天每日腹腔注射0.2ml PBS,骨髓移植第1天(1d)起每日腹腔注射0.2ml (20μg) Ghrelin全第28天；PBS对照组(PP组)：骨髓移植骨髓移植前7天起每日腹腔注射0.2ml PBS至第28天。3.骨髓移植后观察小鼠的一般状况,每周测体重两次,观察GVHD的临床表现及病理改变；骨髓移植后14天、21灭及28天分别测定3组小鼠的胸腺和脾脏指数；取胸腺制备组织切片,显微镜下观察其改变；用流式细胞术检测供受者骨髓嵌合率及脾脏T淋巴细胞亚群；提取胸腺及脾脏细胞DNA,用SYBR Green Ⅰ法实时定量PCR (RT-PCR, real time-polymerase chain reaction)检测胸腺及脾脏细胞中TREC表达量。结果1.接受7.0Gy全身照射(TBI, total-body irradiation)的小鼠能够长期存活,而接受其他三组剂量TBI的小鼠均死丁造血衰竭,表明7.5Gy为最小致死剂量,作为本实验的清髓性预处理方案。分别输注5×106及2×107个骨髓细胞进行移植,发现两组生存率无差异(P0.05),但输注2×107个骨髓细胞的小鼠嵌合率更高。2.骨髓移植后GG、PG、PP组体重均有下降,移植后第7天开始均有增加,体重增减幅度一致。至第28天时,GG、PG、PP组分别增加0.68g、0.19g、0g,虽然移植前后均注射Ghrelin的GG组增重较其他两组稍高,但三组间增重无统计学差异(P0.05)。3.各组小鼠移植后28天骨髓细胞供体细胞嵌合率均达到90%以上,均无明显皮肤受损、弓背及腹泻等GVHD表现,皮肤、肝脏及小肠组织切片未见明显淋巴细胞浸润。4.骨髓移植后的小鼠胸腺和脾脏指数均低于正常水平,通过比较不同组别的可以发现,在移植后同一时间段,三组小鼠胸腺和脾脏指数无统计学差异(P0.05)；在同一组中,移植后14天、21天与28天胸腺和脾脏指数均无统计学差异(P0.05)。5.移植后胸腺均有损伤,主要表现为组织结构受到不同程度破坏,皮质与髓质界限不清,胸腺细胞明显减少；GG组移植后14天,小鼠胸腺结构基本恢复,皮髓质分界清楚,但胸腺细胞较少；移植后21天皮质明显增厚,髓质较14天增厚,胸腺细胞密度增加；移植后28天,髓质明显增厚,且胸腺细胞密度明显增加。PG组在给药14天后,胸腺结构术见恢复,且胸腺细胞较少；给药21天后胸腺细胞有所增加,但皮髓质分界仍不清楚；28天后可见到皮质明显增厚,皮髓质分界较前清晰。仅给予PBS处理的PP组,虽然随着时间的增加,胸腺细胞有所增加,但至28天时,胸腺组织结构仍未恢复,皮髓质界限不清。6.移植后14天各组小鼠T细胞亚群绝对数水平都较低；GG组移植后21天CD4+T细胞明显高于PG与PP组(P0.05),移植后28天这种差异更明显(P0.05),CD4+T细胞数已达到22.03±5.40x105个,CD4+T/CD8+T比值已经为2.16±0.27,几乎接近正常水平。移植后28天PG组的CD4+T细胞数较PP组高(P0.05),达到13.97±3.58×105个,CD4+T/CD8+T比值为1.84±0.54,但PP组的CD4+T/CD8+T比值在移植后第28天仍是倒置的。各组T细胞绝对数的变化主要体现在CD4+T方面,CD8+T在不同时间及刁不同组之间均无统计学差异(P0.05)。7.在移植后第14天,各组小鼠均无法测出脾脏TREC,胸腺TREC表达量也较低；到移植后第21天脾脏和胸腺TREC表达量有所升高,GG、PG、PP组胸腺TREC分别为0.0155±0.0101、0.0133±0.0101、0.0105±0.0056；第28天脾脏TREC继续升高,胸腺TREC反而有所下降,但是上述变化在统计学上并无差异(P0.05),且三个不同处理组问在同一时问点的脾脏和胸腺TREC表达量亦无统计学差异(P0.05)。然而从表达水平上看,胸腺中的TREC表达量明显高于脾脏中的(P0.05)。结论1. BALB/c小鼠接受X射线TBI的最小致死剂量是7.5Gy,输注骨髓细胞输注5×106、2×107个骨髓细胞生存率无差异,后者小鼠嵌合率更高,基于后者建市的骨髓移植模型,无GVHD的发生,是研究移植后免疫重建的良好模型。2.异基因骨髓移植后注射Ghrelin对小鼠体重无影响,对移植后28天内的胸腺和脾脏TREC表达量无影响,不能改善胸腺近期输出初始T细胞的功能。而移植后胸腺功能的恢复是移植后免疫重建的重要环节,需要进一步研究Ghrelin在移植28天后对胸腺功能的影响。3.异基因骨髓移植后连续注射Ghrelin可以促进胸腺结构恢复,增加胸腺细胞密度及脾脏CD4+T数量；但移植前7天就开始连续注射Ghrelin的小鼠胸腺结构恢复较快,胸腺细胞密度更高,脾脏CD4+T数量也更多,说明Ghrelin可促进小鼠异基因骨髓移植后免疫重建,且移植前注射Ghrelin对TBI造成的胸腺损伤有一定的保护作用。Ghrelin免疫重建的促进作用有望应用于临床,并可能成为未来克服移植后免疫重建延迟的重要途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7

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