橡胶树铜离子转运蛋白HbCOPT基因克隆与功能验证

发布时间：2018-06-17 23:20

  本文选题：巴西橡胶树 + 铜离子转运蛋白　； 参考：《海南大学》2017年硕士论文

【摘要】：巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell,Arg)是天然橡胶的主要生产来源,割胶是获得天然橡胶的唯一方法,同时对橡胶树也是一种伤害,前人研究表明胶乳中铜离子浓度平衡在橡胶树抗逆和橡胶生物合成中有重要作用,而铜离子转运蛋白(copper transporter,COPT)是这个平衡机制的关键。铜离子可以诱导橡胶树产生内源乙烯,改变胶乳的品质,铜离子的转运是Ctr/COPT家族参与完成的,研究铜离子转运蛋白在橡胶树中的生物学功能,结合不同刺激强度下铜离子转运蛋白基因表达以及铜离子生理功能,揭示刺激强度与胶乳铜稳态的关系,为研发评价刺激强度的生理指标提供理论基础。乙烯刺激后胶乳中的铜离子含量在24小时内显著性升高,并在24h时达到最高点,表明一定时间内在乙烯刺激下,胶乳中铜离子含量会随着时间的增加而升高。刺激强度较高的乙烯气体刺激比乙烯利刺激更能显著性的提高胶乳中铜离子浓度,初步表明在一定刺激强度范围内,刺激强度与胶乳中铜离子浓度呈正相关。COPT在铜离子转运过程中起关键作用,本研究通过橡胶树基因组序列筛选克隆得到9个HbCOPT候选基因,分别命名为HbCOP71-9。生物信息学分析表明,这9个基因的编码蛋白均具有1个Ctr特征结构域和2-3个植物COPT蛋白典型的跨膜结构域。序列分析显示HbCOPT1、HbCOPT2和HbCOPT3与AtHbCOPT5 同源性较高;HbCOPT4、HbCOPT5 和 HbCOPT6 与 AtHbCOPT6 同源性较高;HbCOPT7、HbCOPT8和HbCOPT9与AtHbCOPT3同源性较高。聚类分析显示HbCOPT可分为3类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),HbCOPT4属于Ⅰ类群,HbCOPT5-6属于Ⅱ类群,HbCOPT1-3属于Ⅲ类群。以上表明克隆得到的9个基因都属于与铜离子转运相关的HbCOPT基因。荧光定量PCR分析HbCOPT基因的表达特性,结果表明除了HbCOPT4和HbCOPT9在橡胶树胶乳中无表达外,其余HbCOPT基因在橡胶树不同组织中均表达,但表达量有明显的差异性,HbCOPT1、HbCOPT4、HbCOPT7、HbCOPT8和HbCOPT9在根部的表达量最高,并且HbCOPT4在根部特异性表达。HbCOPT2、HbCOPT5和6在叶片中表达量最高,HbCOPT3在胶乳中的表达量最高。乙烯处理HbCOPT1、HbCOPT2、HbCOPT3、HbCOPT6和HbCOPT8上调表达,在处理12h时HbCOPT基因的表达量均上调达到最高值,说明HbCOPT受到乙烯刺激调控。增加刺激强度使用乙烯气体割胶后,除HbCOPT7和HbCOPT8基因经处理后的表达量下调外,其余HbCOPT基因表达量均为上调,且显著高于乙烯刺激。乙烯气体刺激割胶处理对HbCOPT的诱导显著性强于乙烯刺激割胶处理,HbCOPT7和HbCOPT8基因经处理后的表达量显著下调,其余HbCOPT基因表达量均为上调。酵母突变体进行功能互补实验结果表明,HbCOPT1-3和HbCOPT7-8这五个基因在酵母中的表达产物具有介导铜离子转运的生理功能,能够使缺陷型酵母突变体(ctr1△ctr3△和ctr1△ctr2△ctr3△)在非发酵碳源(YPEG)培养基上生长。表明这些HbCOPT基因均能编码具有铜离子转运功能的蛋白,其中HbCOPT1和HbCOPT2为高亲和铜离子转运蛋白。本研究表明,刺激强度诱导HbCOPT基因表达,HbCOPT蛋白具有转运铜离子的功能,在一定刺激强度范围内,刺激强度与胶乳中铜离子浓度呈正相关,由此可知,刺激强度与胶乳铜稳态有密切的关系。
[Abstract]:Hevea brasiliensis Muell ( Arg ) is the main source of production of natural rubber , and it is the only method to obtain natural rubber . The results show that the copper ion concentration in the latex is higher than that of AtHbCOPT5 . The results show that the expression of HbCOPT4 , HbCOPT5 , HbCOPT3 and AtHbCOPT3 is high . The results show that the expression of HbCOPT4 , HbCOPT5 and HbCOPT3 is related to the transport of copper ions . The expression of HbCOPT7 and HbCOPT7 - 8 in yeast was up - regulated . The expression of HbCOPT7 and HbCOPT7 - 8 was up - regulated .
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S794.1

【参考文献】

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本文编号：2032900