白氏文昌鱼TAB1基因的克

发布时间：2018-06-22 19:47

  本文选题：白氏文昌鱼 + TAB1基因　； 参考：《南京师范大学》2016年硕士论文

【摘要】：丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)作为丝氨酸/苏氨酸激酶家族,可调控多种生物学过程。TGF-β激活激酶-1(TAK1),也称为丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7),最初是作为MAPK家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶被发现的。TAK1通过介导激活核因子κB (NF-κB)、c-Jun氮末端激酶(JNK)和p38通路来应对白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α和toll样受体的刺激。TAB1(也就是TAK1结合蛋白)是蛋白激酶TAK1的一个调节亚基,并且可以特异性的作用于TAK1氮末端从而直接诱导TAK1激酶活性。文昌鱼在进化过程中作为无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡物种,位于脊索动物的底端,是研究脊椎动物免疫进化的重要材料。为了进一步的研究TAB1基因的功能和进化,本论文首次克隆了白氏文昌鱼的TAB1基因,对该基因序列进行相关生物信息学分析,并且采用原核表达系统成功表达出了白氏文昌鱼TAB1蛋白。通过实时荧光定量PCR技术检测TAB1基因的时空表达模式。实验结果如下：(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆得到白氏文昌鱼TAB1基因全长序列。TABl基因全长为2281bp,其中ORF序列长度为1659bp,可编码533个氨基酸,5’非翻译区长度为89bp,3’非翻译区长度为533bp。利用DNA重组技术构建了PET32a-TAB1表达载体,通过原核表达实验,IPTG低温诱导6h后成功表达出大小为62KDa的特异性蛋白,进一步利用Anti-His tag抗体采用Western blot方法初步验证该特异蛋白就是重组表达的TAB1蛋白。(2)白氏文昌鱼TAB1基因相关生物信息学分析表明：文昌鱼TAB1蛋白序列与其它物种之间相似性高；文昌鱼TAB1基因组由8个外显子和7个内含子组成；文昌鱼TAB1基因序列含有一个特异的PP2Cc结构域；与另外20个物种的TAB1氨基酸序列构建系统进化树,结果表明白氏文昌鱼TAB1位于无脊椎动物和脊椎动物之间且白氏文昌鱼TAB1基因属于TAB1基因家族。(3)通过实时荧光定量PCR技术检测文昌鱼TAB1基因在鳃、肝盲囊、肠、肌肉、脊索和性腺等6个不同组织中的表达量情况,结果表明文昌鱼TAB1基因在各个组织中都有表达,且TAB1基因在性腺中的表达量最高,在肝盲囊、肌肉和脊索中的表达量相对较高,在鳃和肠中的表达量最低。采用实时荧光定量PCR技术检测TAB1基因在LPS刺激后不同时间点(2h,4h,6h,8h,10h,12h,24h和48h)的表达量情况。结果表明文昌鱼TAB1基因在6h时的相对表达量出现差异(P0.05)。本论文首次在白氏文昌鱼中克隆研究TAB1基因,为文昌鱼的先天免疫研究提供新的信息,并为TAB1基因家族的进化研究提供有意义的信息。
[Abstract]:Mitogen-activated protein kinase (MAPKs) is a serine / threonine kinase family. TGF- 尾 activated kinase 1 (TAK1), also known as mitogen-activated protein kinase 7 (MAP3K7), was first found as a serine / threonine kinase in the MAPK family by mediating the activation of nuclear factor- 魏 B (NF- 魏 B) c-Jun nitrogen terminal. Terminal kinase (JNK) and p38 pathway respond to the stimulation of interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor- 伪 (TNF- 伪) and toll like receptor. TAB1 (TAK1-binding protein) is a regulatory subunit of protein kinase TAK1. Furthermore, TAK1 kinase activity can be induced directly by acting specifically on the end of TAK1 nitrogen. Amphioxus, as a transitional species between invertebrates and vertebrates, is located at the bottom of vertebrates and is an important material for studying the immune evolution of vertebrates. In order to further study the function and evolution of TAB1 gene, the TAB1 gene of amphioxus was cloned for the first time, and the sequence of TAB1 gene was analyzed by bioinformatics. The TAB1 protein of amphioxus was successfully expressed by prokaryotic expression system. The temporal and spatial expression patterns of TAB1 gene were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results were as follows: (1) the total length of TAB1 gene was 2281bp.TABl gene was cloned by RT-PCR and RACE-PCR. The length of ORF sequence was 1659bpand the length of 533 amino acid 5'untranslated region was 89bpn3'untranslated region 533bp. The expression vector PET32a-TAB1 was constructed by DNA recombination technique. The specific protein of 62 KDa was successfully expressed after 6h induction by IPTG. The specific protein was confirmed to be a recombinant TAB1 protein by using anti-His tag antibody. (2) the bioinformatics analysis of TAB1 gene in amphioxus showed that the sequence of TAB1 protein in amphioxus was similar to that of other species. The TAB1 genome of amphioxus consists of 8 exons and 7 introns; the TAB1 gene sequence of amphioxus contains a specific PP2Cc domain; and the phylogenetic tree is constructed with TAB1 amino acid sequences of 20 other species. The results showed that TAB1 was located between invertebrate and vertebrate, and TAB1 gene belonged to TAB1 gene family. (3) the TAB1 gene in Gill, liver blind sac, intestine and muscle of amphioxus was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that TAB1 gene of amphioxus was expressed in all tissues, and TAB1 gene was the highest in gonad, and higher in hepatic blind sac, muscle and chordal cord. The lowest expression was found in the Gill and intestine. The expression of TAB1 gene at different time points after LPS stimulation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the relative expression of TAB1 gene in amphioxus was different at 6 h (P0.05). In this paper, the TAB1 gene was cloned and studied in amphioxus for the first time, which provided new information for the study of innate immunity of amphioxus and meaningful information for the evolution of TAB1 gene family.
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q953

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本文编号：2054033