TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究

发布时间：2018-06-25 18:53

本文选题：foxo3a基因编辑 + ALK6突变小鼠　；参考：《广西大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究报道,foxo3a在水牛、猪、鼠类卵泡发育启动方面起着重要作用,foxo3a-/-雌鼠会出现早期全球卵巢卵泡募集,随后会出现卵巢内卵母细胞提前耗尽,造成雌鼠出现早期卵巢功能衰竭和继发性不孕症。自然突变ALK6的Booroola羊即FecB突变类型,单拷贝突变(基因型B+)母羊多产1.11羔,双拷贝突变(基因型BB)增加1.40-1.50只羊羔。故本研究以51bpfoxo3a基因敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察其对小鼠产仔数及相关基因表达模式的影响。TALEN-foxo3a基因编辑小鼠：建立了TALEN-foxo3a基因编辑小鼠(缺失51bp)的PCR鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳PCR产物,foxo3a-/-基因编辑小鼠602bp单一条带,野生小鼠653bp单一条带,foxo3a-/+小鼠602bp和653bp两条带。应用T7E1酶切断基因编辑切口,对PCR产物进行酶切鉴定,可以观察到foxo3a-/+小鼠产生3条带,foxo3a-/-基因编辑小鼠与野生型小鼠为单一大小不同条带。进一步分析653bp的野生型小鼠基因组序列酶切位点含有第270位、第285位和第543位3个PSTI酶切位点,因此野生型小鼠的PCR产物可酶切为110bp和260bp左右的两条带；单敲小鼠的DNA序列能酶切为543bp、110bp和260bp左右的三条带；双敲小鼠DNA序列仅能酶切为543bp和110bp两条带。生物信息分析显示酶切的51bp中恰好包含了foxo3a的第32位苏氨酸位点,一个重要的磷酸化位点。选择foxo3a-/+(?)foxo3a-/+的组合进行交配,对后代鼠进行PCR电泳、PCR加酶切以及测序鉴定显示：后代总生仔数43只,其中单敲阳性数位24只,单敲阳性率为55.81%,双敲阳性数位9只,双敲阳性率为20.93%,总阳性率为76.74%,阳性率符合孟德尔遗传定率。选择鉴定出foxo3a-/-母鼠,对其产仔数进行统计,共统计4窝,平均生仔数为7±1.02a,显著低于野生小鼠9.71±0.71(P0.01)。单敲小鼠foxo3a-/+产仔数共统计13窝,平均生仔数为7.38±0.54只,亦显著低于野生型小鼠(P0.05)。单敲小鼠和野生型小鼠交配共统计生仔数8窝,平均生仔数为7.88±0.35只。利用SPSS分析结果显示：相对于野生型小鼠,双敲小鼠产仔数显著下降(P=0.013),单敲小鼠产仔数也显著下降(P=0.015),双敲小鼠和单敲小鼠产仔数差异不显著(P=0.674)。水牛ALK6点突变FecB基因转基因小鼠：为了探讨ALK6点突变FecB基因是否能够提高水牛繁殖力,本实验以水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察了其产仔数和基因表达变化情况。结果显示：小鼠和水牛ALK6基因编码的氨基酸个数相同均为502个,均无信号肽,分子质量分别为56.9444Kda和56.9234Kda,等电点分别为7.48和7.78,亚细胞定位均在质膜,在374位都有一个磷酸化位点,第24位、第109位和第284位均有糖基化修饰位点。水牛源ALK6点突变转基因小鼠平均生仔数为11.6±0.91只,比野生型小鼠平均生仔数9.71±0.71只多1.89只,但两者统计学差异不显著(P=0.297,P0.05)。QRT-PCR定量结果显示水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸组织中的小鼠ALK6基因相对野生型小鼠表达量均显著下降(P0.05)。水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸中水牛ALK6基因相对于鼠内源ALK6基因表达量均较低。在水牛源ALK6点突变转基因小鼠的卵巢和睾丸中,小鼠ALK6基因和水牛ALK6基因表达量之和均低于野生型小鼠卵巢和睾丸中小鼠本身ALK6基因。结论：水牛源ALK6突变转基因小鼠产仔数有增加,但差异不显著,这与转基因小鼠卵巢中ALK6基因表达的下调有一定的联系。结论：本研究为阐明foxo3a和FecB基因参与哺乳动物繁殖效率的分子机制研究奠定了基础。
[Abstract]:In this study , we studied the influence of foxo3a - / - female mice on the development and initiation of ovarian follicles in buffalo , pig and mouse .
The DNA sequence of single knockout mice can be digested into three bands around 543bp , 110bp and 260bp ;
The results showed that the number of FecB gene was significantly lower than that in wild mice ( P = 0 . 05 ) . The results showed that the expression of ALK6 gene in mouse ovary and testis was lower than that of wild type mouse ovary and testis . Conclusion : The expression of ALK6 gene and buffalo ALK6 gene in mouse ovary and testis is lower than that of wild type mouse ovary and testis .
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814

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