鸡B-L与Ii基因表达产物的结合特性的研究

发布时间：2018-06-28 17:20

  本文选题：鸡 + 恒定链　； 参考：《安徽农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是由一群位于脊椎动物特定染色体区域基因所编码的高度多态性蛋白分子。MHC分子分布于不同细胞表面,参与抗原呈递和调节免疫应答。不同种类动物MHC及其编码产物的名称各异。MHC分子家族中的Ⅱ类分子是由α、β两条链组成的异二聚体。在内质网中它与的γ链聚合,形成九聚体。九聚体中的γ链不同于α和β链,呈非多态性,因此被称为恒定链(Invariant chain,Ii)。Ii是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,白细胞分化抗原编号为CD74。作为MHC Ⅱ分子的重要伴侣蛋白分子,Ii辅助MHC Ⅱ分子的正确折叠、组装、结构维持和协助呈递外源性抗原肽。在与MHC Ⅱ分子的α、β链形成九聚体的过程中,其CLIP区(the class-Ⅱ associated Ii chain peptide)占据MHC Ⅱ类分子的抗原结合槽,阻止内源性抗原肽与MHC Ⅱ类分子结合。Ii与MHC分子的相互作用主要通过原核细胞表达系统进行研究。由于在这两个分子间关系中,需要检测分子间亲和力关系,但是现有的动物真核细胞表达产物难以满足这类实验。为此,本研究探索应用原核表达系统大量表达目的蛋白,以此研究两种分子间的相互作用。首先,根据Gen Bank鸡B-LB(S66480)基因序列,利用自行设计的引物,从实验室保存的各基因cDNA克隆鸡B-LBβ1β2编码区域,将克隆的基因片段分别插入原核表达载体p ET-28a,分别用于转化大肠杆菌Rosetta(DE3)表达蛋白。经PCR、酶切鉴定和测序结果表明成功构建3个重组质粒。其次,将原核表达3个融合蛋白His/B-LB-26-209、218、223并鉴定其表达形式后优化其表达条件后进行大量表达。用反复冻融和超声的方法裂解表达菌,提取融合蛋白,再经复性、纯化、透析。在SDS-PAGE电泳中,His/B-LB-26-209蛋白分子量为26.4 kD,His/B-LB-26-218蛋白分子量为27.4 kD,His/B-LB-26-223蛋白分子量为28.0 kD,与预期大小一致。用这些蛋白复性后免疫印迹检测抗原,结果表明这些原核表达产物具有抗原性。最后,用等温滴定量热(ITC)检测原核表达的B-L和Ii相互作用的解离常数(Kd),反应的焓变和熵变(△H,△S)。结果表明,B-L与Ii之间是相互作用主要是来自于特异性的静电引力和氢键作用力。上述这些结果表明,鸡B-L基因的原核表达的产物能够保持其抗原性,等温滴定量热结果表明原核表达的Ii和B-L蛋白分子复性后它们互相结合并得出亲和力的大小。本研究的结果为进一步研究Ii与B-L分子关系提供方法。
[Abstract]:The main histocompatibility complex (major histocompatibility complexMHC) is a group of highly polymorphic protein molecules. MHC molecules, which are encoded by a group of genes located in specific chromosomal regions of vertebrates, are distributed on different cell surfaces and participate in antigen presentation and regulation of immune response. The names of MHC and its encoded products of different species of animals are different. The class 鈪，

本文编号：2078765