靶向干扰DNMT1基因慢病毒载体构建及其对结肠癌SW620细胞株生物学行为的影响

发布时间：2018-07-01 16:54

  本文选题：DNA甲基转移酶 + 慢病毒　； 参考：《临床和实验医学杂志》2016年23期

【摘要】：目的构建干扰DNMT1基因的慢病毒并感染结肠癌SW620细胞株,观察其对细胞生物学行为的影响。方法合成DNMT1 shRNA寡核苷酸链,与p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP连接构建重组慢病毒质粒,转染HEK293T细胞进行病毒包装。包装后的病毒感染SW620细胞,分为3组:Lentivirus-DNMT1组(LV-DNMT1)、Lentivirus-vector组(LV-vector)、空白对照组(Blank)。采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞DNMT1及T-cadherin表达,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,Transwell和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移。结果成功构建了靶向干扰DNMT1的慢病毒载体。与LV-vector组和Blank组比较,LV-DNMT1组DNMT1 mRNA(0.49±0.09)和蛋白(0.39±0.11)表达显著下调(P0.05),而T-cadherin mRNA(0.74±0.12)和蛋白(0.69±0.13)表达显著上调(P0.05)。与LV-vector组和Blank组比较,LV-DNMT1组第12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时的OD(570)值降低(P0.05),细胞总凋亡率(26.06%)增加(P0.05),穿膜细胞数目[(21.33±8.02)个]和细胞迁移距离[(303.27±47.58)μm]减少(P0.05)。结论 DNMT1慢病毒载体可有效敲减DNMT1表达和上调T-cadherin表达,抑制SW620细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭、迁移能力。
[Abstract]:Aim to construct a lentivirus interfering with DNMT1 gene and infect colon cancer cell line SW620, and to observe its effect on cell biological behavior. Methods DNMT1 shRNA oligonucleotide chain was synthesized and ligated with pCDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP to construct a recombinant lentivirus plasmid. The recombinant plasmid was transfected into HEK293T cells for viral packaging. The infected SW620 cells were divided into three groups: LV-DNMT1 group (LV-DNMT1) and blank control group (Blank). The expression of DNMT1 and T-cadherin was detected by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. MTT assay was used to detect cell proliferation and apoptosis, and cell invasion and migration were detected by cell scratch assay. Results Lentivirus vector targeting DNMT1 was successfully constructed. Compared with LV-vector group and Blank group, the expression of DNMT1 mRNA and protein in LV-DNMT1 group (0.49 卤0.09) and protein (0.39 卤0.11) were significantly down-regulated (P0.05), while T-cadherin mRNA (0.74 卤0.12) and protein (0.69 卤0.13) were up-regulated (P0.05). Compared with LV-vector group and Blank group, the OD (570) of LV-DNMT1 group was decreased (P0.05), the total apoptosis rate (26.06%) was increased (P0.05), the number of perforating cells [(21.33 卤8.02) 渭 m] and the cell migration distance [(303.27 卤47.58) 渭 m] were decreased (P0.05). Conclusion DNMT1 lentivirus vector can effectively knock down the expression of DNMT1 and up-regulate the expression of T-cadherin, inhibit the proliferation of SW620 cells, promote its apoptosis, reduce its invasion and migration ability.
【作者单位】： 上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科上海市微创外科临床医学中心;
【分类号】：R735.35

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本文编号：2088436