固氮施氏假单胞菌环二鸟苷酸（c-di-GMP）代谢相关基因的功能鉴定

发布时间：2018-07-07 19:55

  本文选题：固氮施氏假单胞菌A1501 + 第二信使　； 参考：《安徽农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种广泛存在于细菌中的第二信使,参与调节多种生理功能,包括细胞分化、信号传递、生物膜形成、致病因子产生以及群体感应系统的调控等。c-di-GMP由两个GTP分子经环化酶(DGCs)合成,而被磷酸二酯酶(PDEs)降解。环化酶(GTPs)具有保守的GGDEF结构域,磷酸二酯酶(PDEs)具有保守的EAL结构域。在铜绿假单胞菌中sadC为c-di-GMP合成的关键基因,而bifA基因为c-di-GMP的降解基因,这两个基因分别参与了胞内c-di-GMP的浓度调节,进而影响菌体的运动、生物膜形成等表型。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzei)A1501是一株根际联合固氮菌,c-di-GMP在该菌中的合成、降解机制还未得到鉴定。为研究A1501菌c-di-GMP的合成和降解途径及其对菌株的影响,本研究将A1501中与铜绿假单胞菌sadC和bifA高度同源的两个功能基因作为研究对象。通过构建sadC和bifA功能缺失突变株,测定突变株胞内的c-di-GMP浓度,进而分析c-di-GMP水平的变化对菌体运动、生物膜形成等生理功能的影响。取得的主要研究结果如下:1、基因组分析表明,A1501中含有编码GGDEF结构域蛋白的基因共有33个,含有编码EAL结构域蛋白的基因有17个,其中编号为PST_3133的基因编码氨基酸序列中含有一个GGDEF结构域和一个EAL结构域,与铜绿假单胞菌BifA氨基酸序列同源性高达74%,将其命名为bif A。编号为PST_1148的基因编码包含一个GGDEF结构域的蛋白,与铜绿假单胞菌中已报道的c-di-GMP环化酶SadC同源性达到62%,将其命名为sadC基因。采用三亲结合的方法分别构建了bifA、sadC功能缺失突变株,以及sadC过表达株和突变株bifA的功能回补株进行后续研究。2、对sadC突变株的胞内c-di-GMP含量及表型进行了测定,结果表明sadC的功能缺失对菌体胞内c-di-GMP含量与野生型相比没有明显差异,而且对菌株的生物膜形成能力以及固氮能力没有显著影响,但是菌体运动能力下降;透射电镜观察结果表明,sadC突变株与野生型的鞭毛形态没有明显差异。对sadC过表达菌株的生物膜形成能力进行测定,结果表明sadC过表达菌株的生物膜形成能力比野生型增强约2倍以上。通过测定sadC过表达株胞内c-di-GMP含量发现sadC过表达株胞内c-di-GMP含量与野生型相比,提高约140%,说明sadC参与了A1501菌体内的c-di-GMP合成途径。3、测定bif A突变株的胞内c-di-GMP含量,结果发现与野生型相比bifA突变株胞内c-di-GMP含量增高约2倍以上;测定了bifA突变株的表型,结果显示,与野生型相比,bifA突变株的生物膜形成能力增强约2倍,而bifA突变株的功能回补株生物膜形成能力与野生型类似。由此推测,A1501菌中bifA基因可能是c-di-GMP的降解基因,该基因的功能缺失造成了菌体内c-di-GMP的积累,进而影响了菌体生物膜合成。表型测定也发现bif A的突变降低了菌体的运动能力。4、通过qRT-PCR分析了bifA基因在菌体不同生长期的表达量,结果表明,bifA在野生型A1501的生长初期有较高的表达量,而在指数期及平台期表达量下降,暗示着bifA的表达水平可能与菌体浓度相关。通过添加不同浓度(0、10、20、40μM)的外源c-di-GMP考察对野生型生物膜形成的影响,结果发现外源c-di-GMP没有影响菌体生物膜的形成,推测外源c-di-GMP无法转运至胞内。以上结果表明,在固氮施氏假单胞菌A1501中,c-di-GMP作为细胞重要的第二信使,参与调控菌体的生物膜、运动性等重要生理过程。
[Abstract]:Cyclic diguanosine (c-di-GMP) is a second messenger widely used in bacteria. It participates in regulating a variety of physiological functions, including cell differentiation, signaling, biofilm formation, pathogenicity factor production and the regulation of.C-di-GMP by the synthesis of two GTP molecules via cyclase (DGCs), and degrading by phosphodiesterase (PDEs) and cyclization. The enzyme (GTPs) has a conservative GGDEF domain, and phosphodiesterase (PDEs) has a conservative EAL domain. In Pseudomonas aeruginosa, sadC is the key gene for c-di-GMP synthesis, while the bifA gene is a c-di-GMP degradation gene. These two genes are involved in the concentration regulation of intracellular c-di-GMP, and then affect the movement of the bacteria and the formation of the biofilm. Pseudomonas stutzei A1501 is a combination of rhizosphere nitrogen fixing bacteria and c-di-GMP in the bacteria, and the mechanism of degradation has not been identified. In order to study the synthesis and degradation pathway of A1501 bacteria c-di-GMP and its effect on the strain, two functional genes in A1501 are highly homologous to the sadC and bifA of Pseudomonas aeruginosa in A1501. As a study object, by constructing sadC and bifA functional deletion mutants, the c-di-GMP concentration in the mutant cell was determined, and then the effects of the changes of c-di-GMP level on the physiological function of the mycelium movement and biofilm formation were analyzed. The main results obtained are as follows: 1, the genome analysis shows that the A1501 contains the base of the GGDEF domain protein. A total of 33 genes contain 17 genes encoding EAL domain proteins, including a GGDEF domain and a EAL domain in the sequence of encoded amino acids numbered PST_3133. The homology of the BifA amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa is up to 74%. The gene encoding a BIF A. coded as PST_1148 contains a GGDEF knot. The homology of c-di-GMP cyclase SadC, which has been reported in Pseudomonas aeruginosa, is 62%. It is named sadC gene. BifA, sadC functional deletion mutant, sadC overexpression strain and functional bifA of mutant strain of bifA are constructed by three affinity methods, respectively, for the follow-up study of.2, and the intracellular c-di-G of the sadC mutant strain. The content and phenotypes of MP were measured. The results showed that the functional deletion of sadC had no significant difference to the intracellular c-di-GMP content of the mycelium, but had no significant influence on the biofilm formation ability and nitrogen fixing ability of the strain, but the motion ability of the bacteria decreased. The results of transmission mirror observation showed that the sadC mutant and the wild type whip. The biofilm formation ability of sadC overexpressed strain was measured. The results showed that the biofilm formation ability of sadC overexpressed strain was about 2 times more than that of wild type. By measuring the intracellular c-di-GMP content of sadC overexpressed strain, the intracellular c-di-GMP content of sadC overexpressed strain increased by about 140% compared with that of wild type. The results showed that sadC participated in the c-di-GMP synthesis pathway.3 in A1501 bacteria and determined the intracellular c-di-GMP content of BIF A mutant strain. The results showed that the c-di-GMP content in the bifA mutant was about 2 times higher than that of the wild type, and the phenotype of the bifA mutant was measured. The results showed that the biofilm formation ability of bifA mutant strain increased by about 2 compared with the wild type. The biofilm formation ability of the bifA mutant strain was similar to that of the wild type. Thus, it is assumed that the bifA gene in A1501 bacteria may be a degrading gene of c-di-GMP. The deletion of the gene's function causes the accumulation of c-di-GMP in the bacteria, and then affects the synthesis of the bacterial biofilm. The mutation of the bif A has also found that the mutation of the bif A reduces the transport of the bacteria. Dynamic ability.4, the expression of bifA gene in different growth stages was analyzed by qRT-PCR. The results showed that bifA had higher expression in the early stage of growth of wild type A1501, while the expression level in the exponential phase and platform stage decreased, suggesting that the expression level of bifA may be related to the concentration of the bacteria. By adding different concentrations (0,10,20,40 mu M), the expression level of bifA was related. The effect of c-di-GMP on the formation of wild type biofilm was investigated. The results showed that exogenous c-di-GMP did not affect the formation of the bacterial biofilm. It was suggested that exogenous c-di-GMP could not be transported to the intracellular. The above results showed that in the A1501 of Pseudomonas sp., c-di-GMP was an important second messenger of the cell, and participated in the regulation of the biofilm of the bacteria and the weight of motion. Take a physiological process.
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93;Q78

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本文编号：2106090