水稻抗黑条矮缩病候选基因（qRBSDV-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c）的筛查和初步鉴定
发布时间：2018-07-14 12:21
【摘要】：由水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streaked dwarf virus，，RBSDV)引起的水稻黑条矮缩病(Rice black-streaked dwarf disease)是由灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)(SBPH)以持久性不经卵传的方式传播的一种恶性病毒病,该病可导致水稻矮化、抽穗结实困难,严重的影响了水稻的产量。发掘抗性基因,通过改良水稻自身防卫系统以培育抗性品种是有效预防该病害的重要策略。之前的研究中我们以淮稻5号/乌壳(RBSDV抗性品种)后代分离群体为对象,利用基于简化基因组深度测序技术(SLAF-seq)构建高密度遗传连锁图谱和人工接种鉴定分析获取表型数据的基础上,精细定位出6个水稻黑条矮缩病的抗性QTL,本研究采用电子数据库基因注释、抗感材料基因筛查和转基因功能验证的方法对其中3个抗黑条矮缩病QTL(qRBSDV-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)的进行研究,主要研究结果如下:1)本试验综合水稻全基因组测序数据库、生物信息学和功能基因组学的方法,利用5个数据库(COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、nr)分子功能信息的基因测序报告,对水稻黑条矮缩病3个抗性QTL(qRBSD V-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)进行初步筛选,根据目前已克隆的抗病毒基因的类型筛查出78个候选基因,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,LRR受体蛋白激酶,转录调节因子等。2)分别克隆感病粳稻品种淮稻5号和抗病籼稻品种乌壳中的候选基因,通过测序对这78个基因的核苷酸和氨基酸的序列进行差异性的验证分析,并对存在序列差异性的候选基因在NCBI和SMART等网站分析氨基酸的差异可能引起的功能变化,结果发现候选基因中有21个无核苷酸的差异,14个有核苷酸的差异但无氨基酸的差异,两者的差异都存在但是突变不在蛋白功能区有18个,在淮稻5号或乌壳中多次设计引物仍扩不到正确的候选基因的有13个,核苷酸和氨基酸差异都存在且突变在蛋白功能区的有12个,包括蛋白激酶和蛋白受体,F-box结构域,Myb转录因子等。同时,为进一步验证了这12个候选基因氨基酸突变的稳定性,对后代F2代极抗和极感群体进行单株克隆测序,发现两者之间不但亲本与后代F2代基因序列存在一致性,而且F2代极抗和极感群体仍存在稳定的氨基酸差异。3)对已验证的候选基因进行转基因载体的构建,经T4-DNA连接酶将目的基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301上,并通过对重组质粒的抗性筛选、PCR检测,证实成功构建了植物表达载体pCAMBIA 1301。为验证目的基因在水稻中的功能,将12个候选基因转入感病水稻植株淮稻5号,最后获得8个转基因水稻株系。对获得的转基因水稻植株,首先采用PCR对转基因水稻植株(T0代)的选择标记基因(潮霉素Hyg抗性)进行了检测,结果发现携带潮霉素抗性基因的比率在84.8%到100%之间;对携带Hyg的水稻进行目的基因的PCR检测,比率达100%。单株收取T0代转基因水稻的T1代种子,对T2转基因苗株系的T1代种子进行RBSDV的接毒实验,结果显示每株苗的RBSDV含量都较高,带毒率在68.2%-93.3%之间,部分T1代种子的带毒率低于感病品种淮稻5号,最后还要进一步通过表型分析进行验证转基因水稻的抗性。由于RBSDV同样引起中国玉米粗缩病和小麦}寻
本文编号：2121628
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