牛ACSL1基因的转录调控研究

发布时间：2018-07-15 17:10

【摘要】：牛肉中高含量的不饱和脂肪酸不但改善了牛肉的风味,而且增加了牛肉的营养价值。n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA:DHA,22:6n-3;EPA,20:5n-3)有助于降低人类患心血管疾病、癌症、二型糖尿病的风险;在胎儿期对于完善大脑的功能、视觉的形成起到关键作用;也维持正常生理状态下神经和视觉的功能。长链脂酰Co A合成酶1(Long-chain acyl-Co A synthetase 1,ACSL1)对脂肪酸的激活、转运、降解以及合成起到关键作用。QTL分析认为ACSL1作为最重要位置和功能上的候选基因,直接影响牛肉骨骼肌中多不饱和脂肪酸的组成。ACSL1基因多态性与牛肉骨骼肌中脂肪酸组成和比例呈显著相关,但目前对于该基因的表达调控机制尚未报道。为阐明调控牛肉骨骼肌中多饱和脂肪酸组成的分子机制,改善牛肉品质,提高牛肉营养价值,培育高品质肉牛品种。本研究以秦川牛肉用新品系为研究对象,从细胞水平对关键肉质性状ACSL1基因的转录调控机制进行研究,主要研究内容如下:(1)采用5￠末端c DNA快速扩增法(SMART RACE c DNA Amplification),确定牛ACSL1基因存在多个转录起始位点,它们位于翻译起始位点(ATG)上游20659,20656,20608以及3 bp位。我们将离翻译起始位点(ATG)上游最远的20659 bp位定义为+1,与已报道ACSL1 m RNA序列(NM_001076085)转录起始位点相比,我们将ACSL1基因m RNA序列的5'UTR在原有基础上向前推进7 bp。采用Real-time PCR方法检测发现,ACSL1基因在牛皮下脂肪组织、心脏、骨骼肌、肝脏组织中高丰度表达,而在瘤胃、网胃以及肺组织中表达量很低,揭示该基因可能参与调控牛骨骼肌中脂肪酸的组成。(2)克隆得到牛ACSL1基因5'侧翼序列1954 bp。启动子缺失片段的荧光素活性分析表明,ACSL1基因核心启动子区域位于-325~-140 bp,而且发现Cp G岛位于核心启动子区域内。其核心启动子区域序列与Gene Bank公布的人、小鼠、猪基因启动子序列高度相似。生物信息预测发现,ACSL1基因核心启动子区域存在E2F1、SP1、KLF15和E2F4等保守的转录因子结合位点。另外,ACSL1基因启动子具有典型的真核生启动子元件,TATA-box位于-36位。(3)通过RNA干扰(RAN interfering,RNAi)实验,分别共转染质粒p GL-325/+21和不同剂量的E2F1 si RNA、SP1 si RNA、KLF15 si RNA、E2F4 si RNA以及对照Control si RNA到C2C12细胞中。研究发现,转染不同剂量(1~9 pmol)的E2F1 si RNA使p GL-325/+21启动子活性下降了25%~62%;转染不同剂量的SP1 si RNA使p GL-325/+21启动子活性下降了36%~56%;转染不同剂量的KLF15 si RNA使p GL-325/+21启动子活性下降了20%~39%;转染不同剂量的E2F4 si RNA使p GL-325/+21启动子活性下降了30%~45%,并且启动子活性降低均呈现出剂量依赖性(p0.01)。(4)通过定点突变转录因子结合位点,确定了E2F1、SP1、KLF15和E2F4在维持ACSL1基因启动子活性中的作用。突变转录因子SP1结合位点,启动子活性增加145%(p0.01);而突变E2F1、KLF15和E2F4转录因子结合位点,启动活性下降58%~71%(p0.01);联合突变E2F1和KLF15转录因子结合位点,或联合突变E2F1和E2F4转录因子结合位点,与单独突变E2F1、KLF15和E2F4转录因子结合位点相比,进一步引起启动子活性下降。另外,体外EMSA证实E2F1、SP1、KLF15和E2F4转录因子能够与牛ACSL1基因启动子中相应的顺式作用元件特异性结合。以上结果表明,E2F1( 197 to 181)、SP1( 165 to 149)、KLF15( 164 to 146)和E2F4( 157 to 141)转录因子结合位点是维持牛ACSL1基因启动子基本转录活性必须的顺式作用元件。本研究也为ACSL1基因调控牛骨骼肌中脂肪酸组成的生物学功能和调控机制提供新的科学依据。
[Abstract]:In order to clarify the molecular mechanism of ACSL1 gene and to improve the nutritive value of beef and to cultivate high quality beef cattle breeds . In addition , the ACSL1 gene promoter has a typical eukaryotic promoter element , TATA - box is located at -36 position . ( 3 ) The activity of pGL - 325 / + 21 promoter was decreased by 25 % 锝，

本文编号：2124788