嗜热毁丝霉新调控因子在纤维素酶基因表达调控中的功能研究

发布时间：2018-07-15 20:56

【摘要】：近年来,嗜热酶已经成为酶工程领域的一个重要研究方向,嗜热真菌产生的胞外酶在极端环境下活力相对更高,稳定性更好。具有良好热稳定性的酶在工业生产和生物质能源开发上具有一定的优势。嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)是一种温和的嗜热真菌,最适生长温度介于25-55℃之间,属于丝状子囊真菌(Ascomycetous fungus)。嗜热毁丝霉的基因组已子2011年完成测序。通过对基因组信息的分析显示嗜热毁丝霉能产生200多种葡萄糖苷水解酶和大量的与纤维素和半纤维素降解有关的辅助蛋白。我们从诱导和非诱导培养条件下嗜热毁丝霉的转录谱对比中,筛选出可能参与真菌纤维素酶表达调控的因子STL1和AZF1,并利用同源过表达和RNAi技术对它们分别进行了研究。主要内容如下:(1)本文克隆了嗜热毁丝霉MtSTL1的基因序列,构建重组过表达载体,使用MtPpdc及MtTpdc终止子对该基因进行了同源过表达,并进行酶活测定、荧光定量PC R等实验。研究过表达糖转运蛋白STL1与真菌纤维素酶活性之间的关系。实验成功筛选得到3株重组转化子,其中在转化子S02中,stl1的表达量最高达到野生型菌株该基因表达量的1653倍。在诱导培养条件下生长至第5天时,转化株S02的滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活分别比野生型提高18.6%和49.9%。利用荧光定量PCR技术分析了相对应的纤维素酶基因的mRNA转录水平,也发现了转化株S02中的主要纤维素酶相关基因cbh1,cbh2,egl1,egl3,bgl1的表达量分别是野生型菌株的3.28、2.70、1.66、1.79和1.55倍。本实验结果表明,stl1基因的过表达对嗜热毁丝霉纤维素酶活性具有增强作用,其中β-葡萄糖苷酶(BGase)的表达提高对总纤维素酶活性提高起主要作用。(2)以嗜热毁丝霉中具有C2H2结构域的AZF1转录因子为研究对象,设计azf1基因的siRNA干扰序列,利用嗜热毁丝霉pdc基因的强启动子构建azf1基因的沉默表达盒。实验通过引物特异性PCR验证及测序比对,成功获得3株转化子。通过荧光定量PCR分析azf1基因的mRNA表达水平,发现其中菌株A02沉默效果最明显,但是azf 1基因还是有70.8%的表达量,未能达到预期20%及以下的期望,表明三株转化子在嗜热毁丝霉内都未有效实现RNAi。取效果最好的A02转化子做纤维素酶活性测定和蛋白浓度测定,发现在非诱导条件下总蛋白含量有一定增加,滤纸酶活(FPA)、内切纤维素酶酶活(EG)、及β-葡萄糖苷酶活性(BG)均没有稳定且明显的区别,推测是因为RNAi的效果不够理想。分析可能的原因有:设计的siRNA不佳;转化效率低下;插入位点的随机性造成表达盒未能有效转录表达siRNA;脱靶效应。
[Abstract]:In recent years, thermophilic enzymes have become an important research direction in the field of enzyme engineering. The extracellular enzymes produced by thermophilic fungi have higher activity and better stability in extreme environments. The enzyme with good thermal stability has some advantages in industrial production and biomass energy development. Myceliophthora thermophila is a mild thermophilic fungus with the optimum growth temperature of 25-55 鈩，

本文编号：2125358