PB、SB和Tol2转座子在斑马鱼中的基因转移和基因捕获效率比较研究

发布时间：2018-07-31 08:33

【摘要】：转座子(Transposon, Tn),是在生物界广泛分布的,能够在基因组上自主复制和转移的一段DNA序列。转座子能够有效介导基因转移,在转基因和基因捕获等研究中具有很高的应用价值。目前已经分离到很多高活性DNA转座子,如PiggyBac(PB)转座子Sleeping beauty (SB)转座子和Tol2转座子等,并已经在斑马鱼、小鼠、线虫等模式生物的转基因和基因捕获等研究中得到广泛应用,但目前对PB、SB和Tol2转座子在斑马鱼中的转座特性仍然缺乏深入了解。本研究系统比较了目前研究应用最为广泛的PB、SB和Tol2三种DNA转座子在斑马鱼中的基因转移和基因捕获效率差异,为转座子在相关领域的研究和应用提供参考。本实验主要包括：1、为比较PB、SB、Tol2转座子的基因转移效率差异,将含有鲤鱼的beta-actin启动子(命名为FAG)和绿色荧光蛋白报告基因(Green Fluorecent Protein, GFP)表达盒(FAG-GFP)分别克隆至PB、SB、Tol2转座子框架内,构建成pPB-FAG-GFP、pSB-FAG-GFP、 pTo12-FAG-GFP转基因载体。然后将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA按照5个质量比20ng：10ng,20ng：30ng,20ng：50ng,20ng：80ng,20ng：100ng注射斑马鱼胚胎,获得3个转座子和转座酶最佳注射质量比例。其中SB和PB为20ng：50ng,Tol2为20ng：30ng。再以最佳注射比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测的斑马鱼FO代胚胎的GFP阳性率,结果表明：48hpf和120hpf检测的斑马鱼胚胎中,Tol2的GFP阳性分别为68%和68%(N=872),高于PB(66%和68%,N=885)和SB(64%和65%,N=897),但三者差异不显著(P0.05)；FO代GFP阳性个体饲养至成年后与野生型个体交配获得F1代,对F1代的GFP检测表明：Tol2组的生殖系传递效率最高为46.07%(NF0=231),高于PB组的17.86%(NF0=212)和SB组的13.41%(NF0=199)。2、为比较PB、SB、Tol2转座子的增强子捕获效率差异,将含有斑马鱼krt4基因的基础启动子和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的表达盒(Krt4-GFP)分别克隆至3个转座子框架中,构建成：pPB-Krt4-GFP、 pSB-Krt4-GFP、 pTo12-Krt4-GFP增强子捕获载体。将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA,按照上文优化的最佳比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼F0代胚胎的GFP阳性率,结果表明：Tol2组增强子捕获效率最高,48hpf和120hpf时分别为90.45%和92.71%(N=1524),显著高于PB组(83.18%和83.32%,N=1276),Tol2组在48hpf高于SB组(88.64%,N=1378),但差异不显著(P0.05),在120hpf时显著高于SB组(88.87%,N=1378)(P0.05)。FO代GFP阳性个体饲养至成年后与野生型个体交配获得F1代,对F1代的GFP检测表明：Tol2组生殖系传递效率最高达到55.56%(NF0=165),高于PB组的32.56%(NF0=149)和SB组38.36%(NF0=151)；F1代斑马鱼表达模式分布分析表明：To12能产生最多的单个表达模式的后代,PB则能产生更多表达模式的后代,SB趋于两者之间。3、为比较内部核糖体插入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件对转座子介导的基因捕获效率的影响,将IRES元件插入pTo12-RG-Trap基因捕获载体的PolyA捕获构件的下游,构建成pTo12-GTrap。以不含IRES元件的pTo12-RG-Trap基因捕获载体为对照,分别将pTo12-GTrap和pTo12-RG-Trap两个载体与Tol2转座酶mRNA,注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼FO代胚胎的GFP阳性率,结果表明：pTo12-GTrap组在48hpf和120hpf的胚胎GFP阳性率分别为74.93%和73.91%(N=986),显著高于pTo12-RG-Trap组(41.86%和41.04%,N=853)(P0.05)表明IRES元件能够提高基因捕获效率。4、为比较PB、SB、Tol2转座子的基因捕获效率差异,以构建成pTo12-GTrap为基础,分别用PB和SB转座子框架替换Tol2框架,构建成pPB-GTrap和pSB-GTrap.将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA,按照最优比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼F0代胚胎的GFP阳性率,结果表明：Tol2组基因捕获效率最高(74.93%和73.91%,N=986),显著高于SB组(66.07%和64.02%,N=1025)和PB组(54.23%和53.26%,N=976),且SB和PB之间差异也达到显著水平(P0.05)。综上所述,本研究表明：在斑马鱼中,TYol2转座子的基因转移效率、增强子捕获效率、基因捕获效率和生殖系传递效率最高,IRES元件可以增强转座子介导的基因捕获效率,但在增强子捕获研究中,虽然Tol2转座子能够获得更多的增强子捕获个体,而PB能够获得较多的表达模式,在增强子捕获研究中可能具有更高的应用价值。
[Abstract]:Transposon (Tn), which is widely distributed in the biological community, is a DNA sequence that can be replicated and transferred autonomously in the genome. Transposon can effectively mediate gene transfer and have high application value in the research of transgenic and gene capture. Many highly active DNA transposons, such as PiggyBac (PB) transposon S, have been isolated. Leeping beauty (SB) transposons and Tol2 transposons have been widely used in the studies of transgenic and gene capture in zebrafish, mice, and nematodes, but the transposable characteristics of PB, SB and Tol2 transposons in zebrafish are still lacking in depth. The difference in gene transfer and gene capture efficiency of three DNA transposons of PB, SB and Tol2 in zebrafish can provide reference for the study and application of transposon in related fields. This experiment mainly includes: 1, the difference in gene transfer efficiency of PB, SB and Tol2 transposons, which will contain beta-actin promoter (named FAG) and green fluorescence of carp fish (named FAG) The protein reporter gene (Green Fluorecent Protein, GFP) expression box (FAG-GFP) was cloned into the PB, SB, Tol2 transposon framework and constructed into pPB-FAG-GFP, pSB-FAG-GFP, and pTo12-FAG-GFP transgenic carriers. Then, the 3 vectors were compared with SB, respectively, and transposable enzymes, respectively. The optimum injection mass ratio of 3 transposons and transposes was obtained by injection of 100ng in zebrafish embryos. SB and PB were 20ng:50ng, Tol2 was 20ng:30ng. and zebrafish embryos were injected with the optimum injection ratio. The GFP positive rate of the FO generation embryos of zebrafish detected in 48hpf and 120hpf, respectively, showed that 48hpf and 120hpf detected zebrafish embryos were found. In the fetus, the positive GFP of Tol2 were 68% and 68% (N=872), higher than PB (66% and 68%, N=885) and SB (64% and 65%, N=897), but the three were not significantly different (P0.05), and the FO generation GFP positive individuals were fed to the wild type and obtained the F1 generation. In group 17.86% (NF0=212) and 13.41% (NF0=199).2 of group SB, the enhancers' capture efficiency of PB, SB and Tol2 transposons was compared. The expression boxes (Krt4-GFP) containing the basic promoter of the zebrafish krt4 gene and the green fluorescent protein reporter gene (GFP) were cloned into 3 transposon frames, respectively. Krt4-GFP enhancer capture carrier. The 3 vectors were injected with SB, PB and Tol2 transposes mRNA respectively, and the zebrafish embryos were injected in the optimum proportion. The GFP positive rate of zebrafish F0 generation embryos was detected in 48hpf and 120hpf respectively. The results showed that the capture efficiency of the Tol2 group enhancers was the highest, and the 48hpf and 120hpf were 90.45% and 92.71% respectively. Significantly higher than group PB (83.18% and 83.32%, N=1276), group Tol2 was higher than SB group (88.64%, N=1378), but the difference was not significant (P0.05). At 120hpf, it was significantly higher than group SB (88.87%, N=1378) (P0.05). 55.56% (NF0=165) was higher than that of group PB (NF0=149) and group SB 38.36% (NF0=151). The distribution analysis of F1 generation zebrafish expression pattern showed that To12 could produce the most individual expression patterns, and PB could produce more expression patterns, SB tend to be.3, to compare the internal ribosome insertion site (Internal Ribosome). The effect of Site, IRES) on the gene capture efficiency mediated by transposon, the IRES element was inserted into the downstream of the PolyA capture component of the pTo12-RG-Trap gene capture carrier and constructed into a pTo12-GTrap. with the pTo12-RG-Trap gene capture carrier without IRES elements as the control, and the two carriers of pTo12-GTrap and pTo12-RG-Trap and Tol2 transposin mRNA were taken respectively. The positive rates of GFP in zebrafish embryos were detected by injecting zebrafish embryos at 48hpf and 120hpf respectively. The results showed that the positive rates of GFP in pTo12-GTrap group were 74.93% and 73.91% (N=986) in 48hpf and 120hpf, respectively, which were significantly higher than those of the pTo12-RG-Trap group (41.86% and 41.04%, N=853). The differences in gene capture efficiency of PB, SB and Tol2 transposons were compared. Based on the construction of pTo12-GTrap, Tol2 frames were replaced with PB and SB transposon frames respectively, and pPB-GTrap and pSB-GTrap. were constructed into 3 carriers with SB, PB and Tol2 transposes respectively. The GFP positive rate of the fetus showed that the gene capture efficiency of the Tol2 group was the highest (74.93% and 73.91%, N=986), which was significantly higher than the SB group (66.07% and 64.02%, N=1025) and PB group (54.23% and 53.26%, N=976), and the difference between SB and PB also reached a significant level (P0.05). Hadron capture efficiency, gene capture efficiency and reproductive system transfer efficiency are the highest. IRES components can enhance transposon mediated gene capture efficiency, but in the enhancers capture study, although Tol2 transposons can obtain more enhancers capture individuals, and PB can obtain more expression patterns, may be in the enhancer capture study. Higher application value.
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：2155021