抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株

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第 31 卷 第 1 期 2005 年 1 月 108~ 113 页

作 物 学 报 ACTA AGRONOMICA SINICA

Vol. 31, No. 1 pp. 108- 113 Jan. , 2005

抗草甘膦基因 aroAM12 及抗虫基因 Bts1m 的转基因棉株
赵福永
1000

80) 1

谢龙旭

1, 2

田颖川

3

徐培林

1, * y

( 1 中山大学基因工程教育部重点实验室, 广东广州 510275; 2 河南师范大 学生命科学学院, 河南新乡 453002; 3 中国科 学院微生物 研究所, 北 京

摘 要: 构建了一种新的植物高效表达载体 pAM12 s1m, 其上携带有通过基 因优化( gene shuffling) 技术 获得的抗 草甘膦突 变基因( aroAM12 ) 和抗虫人工合成重组 Bt 基因( Bts1m) 。aroAM12 基 因表达 由 CaMV35S 启 动子控制, Bts1m 基因 表达由 2E 35S 启动子和 8 因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为 外植体, 采用 农杆菌 介导法 将 aro AM12 和 Bts1m 基 因导入 棉花品 种石远 321 中, 以 aroAM12 基因作为选择标记, 草甘膦为选择剂直 接筛选 获得 52 棵再 生植株。PCR 和 Southern blot 分析 表明再生植株均整合有 aroAM12 基因, 其中 38 棵植株同时整合有 aroAM12 和 Bts1m 基 因。Northern blot、 Western blot 分析 进一步证明整合到植株中的两个基因在转录和翻译 水平上进行了 有效表达。离 体叶片草甘 膦抗性和 虫试实 验证明, 获 得的转基因棉花对草甘膦和棉铃虫具有较 强的抗性。 关键词: 转基因棉花; 草甘膦; aroAM12 基因; Bts1m 基因; 选择标记 中图分类号: S562

Glyphosate resistant and Bollworm resistant Transgenic Cotton Plants with the aroAM12 and Bts1m Genes
ZHAO Fu -Yong1 , XIE Long 1, 2 , TIAN Ying -Xu -Chuan3 , XU Pe- Lin1, * i
( 1 The Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education, Zhongshan University, Guangzhou 510275, Guangdong ; 2 College of Life Science , Henan Nor mal University, Xinxiang 453002, Henan ; 3 Institute of Microbiology , Chinese Academ of Sciences, Beijing 100080, China) y

Abstract: A new binary vector, pAM12 s1m, harboring the aroAM12 gene encoding 5 enolpyruvy- shikimate - phosphate l -3 synthase ( EPSPS) and a synthetic recombinant Bts1m toxin gene consisting of 331 N -terminal amino acids of CryIAc and 284 C terminal amino acids of CryIAb was constructed1 The truncated aroAM12 gene, which was obtained through gene shuffling technology, was ligated with a transit sequence of Arabidopsis EPSPS and expressed in cotton plants, and driven by cauliflower mosaic virus 35S ( CaMV35S) promoter1 The chimeric Bts1m toxin gene was fused with DNA sequence en coding PR1b secretary signal peptide and expressed under the control of 2E 35S promoter and / 80 translation enhancer se quence derived from tobacco mosaic virus1 The mutant EPSPS of aroAM12 gene product conferring highly resistant to glyphosate, the active ingredient in herbicide Roundupo , was used as a dominant selectable marker for cotton plant trans formation1 The genes were introduced into commercial cultivar Shiyuan 321 of cotton ( Gossypium hirsutum L1) by Agrobac terium -mediated transformation1 The transformants were selected directly on medium supplemented with 80 LmolP glypho L sate1 In this research, 52 regenerative cotton plantlets were obtained through screening1 Integration of aroAM12 and Bts1m genes was confirmed by PCR and Southern blot, the results indicated that all the 52 plants possessed the aroAM12 gene, 38 of which possessed both the aroAM12 and Bts1m genes1 Expression of both the genes was proved by Northern and West ern blots analyses1 Insect bioassay and glyphosate resistance assay indicated that the transgenic cotton plants obtained were highly resistant to glyphosate and insect1 Key words: Transgenic cotton; Glyphosate; aroAM12 gene; Bts1m gene; Selective marker
R

棉花是一种重要的经济作物, 近年来杂草和虫 害已成为制约皮棉产量和质量的两个主要因素。常

规育种途径因抗性种质资源匮乏而难以解决问题, 因此利用基因工程技术, 将抗除草剂基因和抗虫基

y

基金项目: 国家/ 8630 高技术研究发展计划( 2001AA212191) 和广州市科技计划( 2001 Z -01) 资助。 - -040 作者简介: 赵福永( 1976- ) , 男, 湖南衡山人, 博士研究生, 研究方向: 植物基因工程。 * 通讯作者: 徐培林。Tel: 020 -84038085; E -mail : 13640737322@ 1631 net Received( 收稿日期) : 2003 -20, Accepted( 接受日期) : 2003 -031 -06 -12

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因同时导入棉花, 培育抗除草剂和抗虫双抗转基因 棉花新品种, 一方面不仅可以降低植棉投入, 增加棉 农收入, 另一方面还可简化棉花栽培体系, 在农业生 产上具有重要意义。同时, 抗除草剂基因在棉花杂 交育种上还可作为重要的遗传标记。目前已有多种 [ 1] 抗除草剂和抗虫转基因棉花报道, 国外Tro linder [2] [ 3] 与 Bayley 将 抗 2, 4 D 的 tf dA 基因、 Keller 将 抗 PPT 的 bar 基因 成功导入到棉花中, 获得抗 除草剂 [ 4] 转基因棉花。Monsanto 公司的 Perlak 等将 Bt 基因 导入到棉花中, 并开始商品化生产。国内学者也相 继将抗 2, 4 的 tf dA 基因和改造过的系列 Bt 及双 -D [ 5~ 8] 价抗虫基因转入到棉花中 。国外将草甘膦抗性 基因转入到烟草、 番茄等作物的研究较多, 但成功转 [ 9] 化棉花的报道很少。Nida 等 将 CP4 EPSPS 编码基 因转化棉花, 该基因只作为草甘膦抗性的目的性状 基因, 而不作为选择标记。国内还未见将草甘膦抗 性基因转入到棉花中的报道。本研究所采用的草甘 膦抗 性 基因 aroAM12 是 通 过基 因 优 化技 术 ( gene [ 10] shuffling) 而获得, 抗虫基因 Bts1m 由中国 科学院 微生物研究所田颖川研究员等改造人工合成。应用 分子克隆技术将该两个基因整合到同一个质粒上, 构建成植物高效表达载体。采用农杆菌介导法转化 棉花, 并首次利用 aroAM12 基因为选择标记, 直接应 用草甘膦筛选获得抗草甘膦抗虫双抗转基因棉花。

用 Hind ? + Xba ? 分 别 切 割 pBtpCR211 和 pGRA1300, 回收相应片段, 连接后得到 植物高效表 [ 11] 达双元载体 pAM12 s1m( 图 1) , 采用氯化钙法 将 pAM12 s1m 转化农杆菌 LBA4404。 115 棉花的转化及再生 将 3~ 5 日龄的无菌苗下胚轴切成 3~ 5 mm 切 段, 用含 pAM12 s1m 质 粒 的农 杆 菌 LBA4404 菌液 ( OD600 = 016) 感染 7 min, 灭菌滤纸上吸干残余菌液 后, 接种到铺有一张灭菌滤纸的共培养基上( MS + 3% 葡萄糖+ 011 mgP 2, 4 + 011 mgP KT + 200 L -D L mgP 乙酰丁香酮 + 012% Gelrite, pH 510) 。暗培养 L 48 h 后, 转移到愈伤组织诱导培养基上( MS + 3% 葡 萄糖+ 011 mgP 2, 4 D + 011 mgP KT + 500 mgP L L L Cef + 012% Gelrite, pH 518) , 培养一周后转移到含 80 L P 草甘膦的相同培养基上, 诱导抗性愈伤组 mol L 织的形成, 每 30 d 继代一次。2~ 3 个月后, 将诱导 出的抗性愈伤转移到增殖培养基( MS + 3% 葡萄糖 + 0191 gP MgCl2 + 012% Gelrite, pH 518) 上, 待出现 L 米粒状胚性愈 伤时, 转移到 分化培 养基 ( 无 NH 4 、 KNO3 加倍的 MS+ B5 + 1 gP 天门冬酰胺+ 2 gP 谷 L L 氨酰胺+ 2% 葡萄糖+ 0125% Gelrite, pH 518) 上, 诱 导胚状体的成熟和植株再生, 待再生苗形成良好根 系时, 采用低温移植法将其移栽到大棚中; 对于无根 或根生长不好的转基因苗采用嫁接法移栽。 116 再生植株的 PCR 分析 棉花 DNA 的提取参照 Bushra 等 的方法。根 据 aroAM12 和Bts1m 基因序列, 设计两对特异性引 物。aroAM12 基 因 特 异 引 物 P1: 5c CATGCCATG GAATCCCTGACGTTACAA 3 P2: 5c CGCGGATCCT - c, TAGC AGGCTACTCATTC 3 Bts1m 基因特异引物 P3: - c; 5-TATCCCATTGTTCGCAGTCC 3 P4: 5-CATCACGA c - c, c CTCAAGTTGTTA 3c。 反 应 参 数 为: 94 e 预 变 性 5 min; 94 e 1 min, 54 e 1 min, 72 e 1 min, 循环 30 次; 72 e 延伸 10 min。 117 转基因棉花离体叶片草甘膦抗性实验 试验叶片取自相同叶期转基因和非转化植株, 分别置于培养皿中, 叶柄处用沾水棉球保湿, 用不同 R 浓度的草甘膦( Roundup o , Monsanto) 均匀涂抹叶片, 观察叶片受损伤情况。 118 转基因棉花抗虫实验 将经 PCR 检测呈阳性( Bts1m 基因) 的棉花转化 株主茎第 5 叶放入垫有浸湿滤纸的培养皿中, 以非 转化 株作为 对照, 以 2 龄 棉铃虫 ( Helicoverpa armigera, 中山大学生物防治国家重点实验室提供) 作为 受试虫, 每皿接种 6 头, 置于( 25 ? 2) e 和 16 8 h 光 P
[ 12] +

1
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材料与方法
菌株和质粒

大肠杆 菌 XL1 Blue 和根 癌农杆菌 LBA4404 由 本实验室保存, 含 Bts1m 基因的质粒 pBts1m 由中科 院微生物所田颖川研究员赠送, 含 aroAM12 基因的 pGRA1300、 pCR211M12 质粒由本实验室构建并保存。 112 植物材料 陆地棉栽培品种石远 321 种子由中国农科院棉 花研究所刘正德研究员馈赠。 113 酶与试剂 各种限制性内切酶、 连接酶等购自 Promega 公 TM 司; Hexal Label Plus DNA Labeling Kit 、 Western Blot Kit BCPIP NBT System 购自 MBI Fermentas 公司; 草甘 R 膦( Roundup o ) 购自 Monsanto 公司; PCR 引物由上海 博亚( BioAsia) 生物技术公司合成。 114 植物表达载体的构建 用 Hind ?+ Sal ?酶切质粒 pBts1m, 回收含 2E 35S 8 BtS1m 片 段; 用 Hind ? + Xho ? 酶 切 质 粒 - pCR211M12, 回收含 Nos 片段, 将回收的 两 DNA 片 段经 T 4 DNA Ligase 连接 后, 得到 pBtpCR211 质粒。

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暗周期的培养箱中。接虫后第 3、 天统计死亡率、 6 活虫体重及叶片受害情况。 119 转基因棉花 Southern blot 分析 取 10 L 总 DNA, 经 Hind ?完全酶切后, 018% g [ 11] 琼脂糖凝胶电泳, 参照5分子克隆实验指南6 方法 转膜与杂交。 1110 转基因棉花的 Northern blot 分析 棉花 RNA 的提取参照夏兰芹等的方法 。取 10 L RNA, 112% 甲醛变性凝胶电泳, 参照5 分子克 g [ 11] 隆实验指南6 方法转膜与杂交。 1111 转基因棉花 Western blot 分析 [ 9] 棉花可 溶性粗蛋白的 提取参照 Nida 等的 方 [ 14] 法。采用 Bradford 法测定蛋白浓度 。参照 West ern Blot Kit 所提供的方法, 分别用 EPSPS 抗血清( 兔 抗血清, 效价 1B200, 实验室自制) 和 Bt 毒蛋白抗血 清( 兔抗血清, 效价 1B250, 田颖川研究员赠送) 进行 Western blot 检测。
[ 13]

区序列, 同时在该基因的前面加有增强翻译功能的 烟草花叶病毒( TMV) RNA 的 8 片段编码序列和 2E 35S 强启动子序列。

图1 Fig 1 1

植物表达载体 pAM12 s1m -

Construction of the plant expression vector pAM12 s1m -

2
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结果与分析

植物双元表达载体 pAM12 -s1m 的构建 本研究将 aroAM12 和 Bts1m 基因整合到同一个 质粒 中, 得 到 抗草 甘 膦、 虫植 物高 效 表达 载 体 抗

212 再生棉花植株的 PCR 检测 通过草甘膦直接筛选共获得 52 棵再生植株, 用 aroAM12 基因特 异性引物扩增, 均出现 预期的 113 kb 片段; 用 Bts1m 基因特异性引物扩增, 其中有 38 棵植株出现预期的 0196 kb 片段。该结果表明在携 带有外源基因的 T -DNA 片段整合到植物基因组的 过程中, 约有 2619% ( 14P 的 Bts1m 基因丢失。图 52) 2 为部分转化植株 PCR 扩增结果。 213 转基因棉花的草甘膦抗性检测 选取主茎第 5 叶进行离体试验, 用不同浓度的 草甘膦 涂抹, 5 d 后对照叶 片在 10 mmolP 变 黄枯 L 萎, 而转基因棉花叶片在 50 mmolP 逐 渐失绿变黄 L ( 图 3) , 表明在离体条件下, 棉花抗性提高了约 5 倍。

pAM12 s1m ( 图 1) 。在 aroAM12 基因 5 端连接了一 c 段 240 bp 的拟南芥 EPSPS 信号肽 ASP 编码区序列, 该基因表达由 CaMV35S 启动子控制。在 Bts1m 基因 5c端添加了烟草致病相关蛋白的信号肽( PR1b) 编码

图2 转化棉花株的 PCR 检测 Fig12 PCR analysis of putative transformants and untransformed cotton pl ants ( A) : aroAM12 引物扩增; ( B) : Bts1m 引物扩增; Lane M : DNA marker; Lane P: pAM12 -s1m 质粒; Lane N : 非转化植株; Lanes 1~ 10: 转化植株 PCR analysis using two primer sets: aroAM12 ( A ) and Bts1m ( B) gene specif ic; Lane M: DNA marker; Lane P: pAM 12 s1m plasmid; Lane N: Untransformed plant ; Lanes 1- 10: Put ative transformants

图 3 转基因棉株离体叶片对草甘膦的抗性 Fig13 Anal ysis of transgenic cotton resistance to gl yphosate TG : 转基因植株; CK: 非转化植株。从左到右草甘膦的涂抹浓度依次为 0、 10、 50 mmol L1 5、 30、 P TG : Transgenic plant ; CK: Untransformed plant1 The concentrat ion of glyphosate swabbed from left to right is 0, 5, 10, 30, 50 mmolP respectively1 L,

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转基因棉花抗棉铃虫检测 抗虫性比较发现, 大部分转化植株( Bts1m PCR

因的 T DNA 向植 株染色体 整合的过 程中, 有部分 Bts1m 基因的丢失, 这一结果同 PCR 结果相符合。

阳性) 表现出明显的抗虫性, 叶 片仅被取食几 个小 孔, 受试虫就死亡, 而对照叶片则大部分被取食。图 4 为经过 3 d 后部分叶片被棉铃虫取食的情况。其 具体发育和死亡情况见表 1。 215 转化棉花的 Southern blot 分析 随机挑 选的 6 株棉花 的总 DNA 进 行 Southern

blot 分析。杂交结果表明, 1~ 6 号株均出现了杂交 信号, 结 合 图5 可 以 推断 出其 杂 交 条带 数 就 是 -A aroAM12 基因插入植株的拷贝数, 分别为 2、 2、 1、 1、 1、 图 5 B) 。对于 Bts1m 基因, 只有 1~ 4 号株出现 1( 了杂交信号, 其拷贝数依次为 1、 3、 而 5、 号两 2、 1, 6 棵转化植株同对照植株一样, 无杂交信号 出现( 图 5 C) 。这一结果表明在携带有 aroAM12 和 Bts1m 基 表1 Table 1 图4 转基因棉花对棉铃虫( Helicoverpa armigera ) 的抗性 Fig14 Leaf bioassay of transgenic cotton leaves against Heli coverpa armigera

1~ 3: 转基因植株; 4: 非转化植株。 1- 3: Transgenic plant ; 4: U ntransformed plant1

转基因棉花对棉铃虫( Helicoverpa armigera ) 的抗性结果

Effects of transgenic cotton on survival and development of Helicoverpa armigera second instar larvae at three and six days infestati on 死亡率 Mort ality ( % ) 3 days 8515 8010 6510 8510 8210 8415 7010 8515 0 6 days 100 9010 8010 100 100 9510 8315 100 0 存活幼虫体重 Weight of survival H 1 a1 ( mg) 3 days 0175 ? 0 30 1 0 8 ? 0 20 1 1 0 8 ? 0 35 1 1 0165 ? 0 28 1 0 7 ? 0 25 1 1 0175 ? 0 33 1 0185 ? 0 20 1 0175 ? 0 25 1 5 5? 0 4 1 1 叶片受损级别 Leaf damage grade + + + + + + + + + + + + + + + + + +

植株编号 No1 of plant 1 2 3 4 5 6 7 8 CK

注: 1~ 8: 转基因植株; CK: 非转化植株 1 N otes: 1- 8: Transgenic plant s; CK : Unt ransformed plant1

图 5 转基因棉花植株 Southern blot 分析 Fig 5 1 Southern blot analysis of transgenic cotton plants ( A) pAM 12 s1m T-DNA 区域示意图。T 0 代棉花基因组 DNA 经 H in d? 酶切后分别与( B) aroAM12 和( C) Bts1m 基因特 异性探针杂交。N : 非转化植株 DNA; 1~ 6: 转化植株 DNA。 ( A) Schemat ic map of the T-DNA of the binary vector pAM12 -s1m1 Total genomic DNA of T 0 transformants was digest ed wit h Hi nd ? and hybridized with aroAM12 DNA fragment ( B) or with Bts1m DNA fragment ( C) Lane N: Untransformed plant; Lanes 1- 6: Transformants1

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转基因棉花的 Northern blot 分析 Northern blot 结果表明, 用 aroAM12 基因探针杂

Bts1m 基因在转录水平上得到了表达。 217 转基因棉花的 Western blot 分析 为检测 aroAM12 和 Bts1m 基因是否正确表达出 EPSPS 和 Bt 毒蛋白, 取 10 L 总的可溶性蛋白进行 g Western blot 分析。图 7 中, 6 个随机挑选的转基 -A 因棉花粗蛋白样品同 EPSPS 抗血清杂交后均在 48 kDa 处出现杂交带, 同阳性对照 结果完全相同。图 7 B 中, 同样的蛋白样品同 Bt 毒素蛋白抗血清杂交 后, 只有 1~ 4 出现了同阳性对照相同大小的 68 kDa 杂交带, 且杂交信号存在一定差异。

交时, 1~ 6 号转化植株均出现了 1130 kb 左右的杂 交条带, 与预期值大小相近, 而非转化植株未出现任 何杂交信号, 表明 aroAM12 基因在转录水平上进行 了有效表达。从杂交信号上看, 2 号植株最强, 1、 3 号次之, 4、 6 号相对较弱( 图 6 5、 -A) 。用 Bts1m 基因 探针杂交时, 只有 1~ 4 号株出现了 0196 kb 左右的 杂交条带, 与期望值大小相近, 有 2 株转化植株( 5、 6 号) 未出 现杂 交信 号( 图 6 B) , 表明 1~ 4 株中 的 -

Fig 6 1

图 6 转基因棉花植株 Northern blot 分析 Northern blot analyses of transgenic cotton plants

N: 非转化植株; 1~ 6: 转化植株。植株 RNA 分别与 aroAM12 ( A ) 和 Bts m ( B) 基因探针杂交。 1 Line N : Untransformed plant ; Lanes 1- 6: Cotton transformant s The RNA was hybridized with aroAM12 DNA fragment ( A) 1 or with Bts m DNA fragment ( B) 1 1

Fig 7 1

图7 转基因棉花植株 Western blot 分析 Western blot anal ysis of transgenic cotton plants

( A ) : EPSPS 抗血清检测。M: 分子量标记; P: EPSPS 蛋白; N : 非转化植株; 1~ 6: 转基因植株。 ( B) : Bt 毒蛋白抗血清检测。 : 分子量标记; P: Bt 毒素蛋白; N: 非转化植株; 1~ 6: 转基因植株。 M ( A) : The EPSPS prot ein of aroAM12 gene product was detected using ant- EPSPS serum M: Molecular marker; Lane P: EPSPS prot ein; i 1 Lane N : Untransformed plant1 ( B) : The Bt toxin protein of Bts1m gene product was det ected using ant- Bt toxin i serum1 M : Molecular marker; Lane P: Bt toxin protein; Lane N : Untransformed plant; Lanes 1- 6: Transformants1

3

讨论
目前, 棉花转化过程中的筛选标记基因大部分

下降, 导致草甘膦抗性水平的提高

[ 10]

。构建高效表

达载体时, 在 aroAM12 基因上游连接了一段来自拟 南芥 EPSPS 信号肽 ASP 编码区序列, 从而能够大大 提高转基因植株的抗性, 因为整个芳香族氨基酸的 合成过程是在 叶绿体中进行
[ 15]

采用 npt ?( 新霉素磷酸转移酶) 基因或 htp ( 潮霉素 磷酸转移酶) 基因。草甘膦作为除草剂具有广谱、 高 效、 低残留量的特性, 是一种理想的筛选剂。草甘膦 作用的靶标酶是莽草 酸羟基乙烯转移 酶( EPSPS) , 其作用机制在于抑制植物体内芳香族氨基酸的生物 合成。抗草甘膦育种通常有 3 条途径: 导入修饰的 或突变的酶靶基因; 导入过量表达的酶靶基因; 导入 草甘膦降解酶基因。本研究所采用的草甘膦抗性基 因 aroAM12 是通过基因优化技术( gene shuffling ) 获 得的, 其表达产物在多个氨基酸位点发生突变, 造成 酶对底物 PEP 亲和性增加, 同时对草甘膦的亲和性

的。采用农杆菌介

导法, 以 aroAM12 为选择标记基因筛选出的 T 0 代转 化植株抗草甘膦, 说明草甘膦是一种有效的筛选剂。 Bts1m 基因是人工合成的重组基因, 即由 CrylAb N 端的 331 个氨基酸和 CrylAc C 端 284 个氨基酸组合 而成
[ 16]

。在该基因的 5 c端有加倍的增强子元件 2E -

35S 以增强基因转录功能; 5c端 8 序列是蛋白质翻 译过程中核糖体的结合位点, 可大幅提高蛋白质的 [ 17] 表达量 。另外, 为使植物表达的 Bt 杀虫蛋白能 分泌到细胞 外间 隙以提 高杀 虫蛋白 的稳 定性, 在

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Bts1m 基因前添加 了烟草致 病相 关蛋白 的信号 肽 ( PR1b) 编码区序列, 其作用与 ASP 序列类似。该基 因 3c端的 polyA 序列的添加, 提高了杀虫基因 mRNA 的稳定性。通过筛选得到的抗虫棉花植株尽管单株 间所表现出的抗性呈现一定的差异, 但抗虫能力都 较强, 并且植株的其他生长性状并未受到影响, 说明 组建的嵌合 Bts1m 基因进行了充分的表达。South ern blot 结果表明不同转基因植株中的外源 基因的 拷贝数 和整 合位 点 均不 完全 相同。结 合 Northern blot、 Western blot 及棉花离体叶片草甘膦抗性和虫试 结果分析发现, 转基因植株抗性的强弱同插入的基 因拷贝数并不呈正相关, 有些多拷贝插入的植株抗 性反而较低, 这可能是由 基因沉默现象造成的
[ 18]

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。

关于转化植株中 aroAM12 和 Bts1m 基因能否稳定地 遗传给后代以及遗传方式如何, 有待进一步的研究 和分析。
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  本文关键词：抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株，由笔耕文化传播整理发布。